L-组氨酸产生菌的选育及其发酵条件优化

本文以谷氨酸棒杆菌AJ88为出发菌株,对L-组氨酸的发酵法生产进行了研究。主要内容及结果如下: 1)以组氨酸的茚三酮显色和Pauly特征显色为根据,结合纸层析法,确定利用Pauly显色和茚三酮显色相结合对发酵液中的L-组氨酸进行定性分析,采用点样纸层析茚三酮显色后洗脱再比色来定量测定发酵液中的L-组氨酸,茚三酮显色洗脱液最佳吸收波长为510nm,最佳洗脱时间为30min,当点样组氨酸含量在2μg12μg范围内时呈现较好的线性。 2)对出发菌用DES和NTG逐级诱变处理,采用8-氮鸟嘌呤（8-AG）,2,6-二氯嘌呤（DCP）,硫唑嘌呤（SP）,2-硫尿嘧啶（2-TU）,氨基三氮唑（AMT）以及1,2,4-三唑丙氨酸（TRA）作为抗性药物进行选育,并使菌株带上组氨酸酶缺陷型标记,最终获得一株能够较多积累L-组氨酸的菌株HZ5013（TRAR, AMTR, histidase-, DCPR, 2-TUR）。在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中发酵3d,产酸可达4.63g/L,比出发菌株产酸提高了近2倍。 3)对菌株HZ5013进行了培养基和发酵条件的优化。得到最佳的种子培养基为（g/L）:葡萄糖25,（NH4）2SO4 10,玉米浆25,KH2PO4 1.5,MgSO4·7H2O 1,CaCO3 20,VH 10μg/L;最佳发酵培养基为（g/L）:葡萄糖80,（NH4）2SO4 31,玉米浆5,KH2PO4 1.3,MgSO4·7H2O 0.5,CaCO3 20,VH 5μg/L;摇瓶发酵最佳培养条件为:培养基初始pH7.0,接种量8%,装液量为15mL/250mL摇瓶或20mL/500mL摇瓶,往复式摇床30±1℃培养,摇床转速100次/min,发酵周期72h。优化后最终产酸可达5.5g/L。 4)考察了添加氨基酸、有机酸、维生素、各种营养源等以及改变培养手段对L-组氨酸代谢的影响。实验发现添加0.1g/L L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-脯氨酸时,产酸有所提高。添加其它氨基酸均使产酸有所下降。添加丙酮酸、草酸、乙酸能使产酸明显有所提高,添加琥珀酸、苹果酸、富马酸使产酸有所下降。添加各种维生素对L-组氨酸产量的影响很小,少量添加产酸略高。添加蛋白胨、牛肉膏和酵母膏会导致产酸降低,而添加豆饼水解液对产酸有一定的促进作用。在培养基中添加表面活性剂吐温80和稳定剂植酸钠均会抑制菌体生长并导致产酸下降。流加葡萄糖和氨水产酸均优于不流加时的产酸。