黑木耳多糖的分离制备及生物活性研究

多糖具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、调节免疫和抗氧化等生物活性,存在于动物、植物和微生物中。本文以黑木耳为原料,采用高速逆流色谱和柱层析方法,探索出一套完整的黑木耳多糖活性成分提取、分离、纯化的工艺,得到5种不同的黑木耳同多糖。同时对分离纯化的多糖进一步研究其生物活性,对肿瘤的抑制率、调节免疫能力、改变肿瘤细胞膜特性和抗氧化活性进行了研究,并探讨了其功能与结构之间的关系,以期为进一步开发利用黑木耳提供试验依据。 研究结果如下： 1.设计了三类不同的HSCCC双水相溶剂系统：PEG—磷酸盐系统、PEG—硫酸铵系统、PEG—Dextran—磷酸盐系统。应用正交试验方法根据HSCCC溶剂系统的分离条件,筛选得到了2种可用于HSCCC分离的溶剂系统：PEG1000:Dextran:K2HPO4:KH2PO4: H2O=8:3:20:30:120 (w/w)和PEG1000:K2HPO4:KH2PO4:H2O =0.5:1.25:1.25:7.0 (w/w)系统,本文选用PEG1000:K2HPO4: KH2PO4:H2O=0.5:1.25:1.25:7.0 (w/w)系统作为HSCCC的分离系统。 2.确定了HSCCC分离条件,转速700rpm,流速2.5mL/min,上样量2.0g,并从组分AAFRA中分离得到三种多糖AAPS1、AAPS2和AAPS3,质量分别为192mg、137mg、98mg。 3.组分AAFRB、AAFRC采用DEAE-cellulose、Sephacryl S-500HR柱层析进行分离纯化,得到了纯化后的AAFRB和AAFRC,所得量分别为120.5mg、92.7mg。4.采用HPGPC、PMP-HPLC、UPLC、1D NMR、2D NMR、GC-MS、FTIR等方法对得到的黑木耳多糖AAPS1、AAPS2、AAPS3、AAFRB和AAFRC的结构进行了研究。5种多糖均是由葡萄糖构成的同多糖,分子量分别为：1.62×105、2.59×105、4.83×105、9.30×105、1.20x 106Da,20℃时的比旋光度[α]D分别为：+89.30、+24.7°、+112.6°。+49.6°、+61.20；AAPS1是以(1→6)-a-D-吡喃葡萄糖和(1→3,6)-β-D-吡喃葡萄糖为主链,并在p-D-吡喃葡萄糖的O-3出现支链→4)-α-D-吡喃葡萄糖-(1→；AAPS1: AAPS2是以(1→3)-p-吡啶葡萄糖残基和(1→3,6)-p-吡啶葡萄糖残基为主链,数量比为2：1,并在(1→3,6)-p-吡啶葡萄糖残基的O-6处有支链(1→)-p-吡啶葡萄糖残基；AAPS2: AAPS3分子中存在→4-β-D-Glc-1→3-β-D-Glc-1→,→3-β-D-Glc-1→4-p-D-Glc-1→6-w3-D-Glc-1→片段,是以β-D-1,4-Glc,β-D-1,3-Glc和β-D-1,6-Glc残基构成主链的葡聚糖；AAPS3: AAFRB是由→4)-α-D-Glcp-(1→、→3)-α-D-Glcp-(1→、→3,6)-α-D-Glcp-(1→、α-D-Glcp-(1→、→3)-β-D-Glcp-(1→残基构成,个数比为6：1：1：2：1,并在→3)-α-D-Glcp-(1→的O-6有支链α-D-Glcp-(1→吡啶葡萄糖残基；AAFRB: AAFRC是→4)-α-D-Glcp-(1→、→3)-α-D-Glcp-(1→、α-D-Glcp-(1→、→4)-β-D-Glcp-(1→和→3)-β-D-Glcp-(1→片段构成,个数比为10：3：4：1：3,并在→3)-α-D-Glcp-(1→的O-6有支链α-D-Glcp-(1→吡啶葡萄糖残基的葡聚糖,AAFRC: 以上5种多糖化合物经查阅相关文献未见报道。 5.采用S180肉瘤小鼠模型研究了黑木耳多糖的抗肿瘤活性、对肿瘤细胞膜特性的影响和免疫学活性。结果表明5种多糖均具有一定的肿瘤抑制率,并且AAPS2和AAFRB能显著提高荷瘤小鼠的肝指数,AAFRB能显著提高胸腺指数；5种多糖均能促进细胞膜磷脂的降解,且与CT组间存在极显著差异(p<0.01),表现出较好的改变肿瘤细胞膜结构的特性；对细胞膜脂流动性(LFU)的研究发现,AAPS2、AAFRB、AAFRC能显著改变细胞膜脂的流动性(p<0.01)；免疫学特性来看,AAPS3、AAFRB多糖对促进脾淋巴细胞增殖有显著作用；除AAPS1的低剂量组外,多糖显示出能显著提高小鼠血清半数溶血值HC50,表明多糖可促进小鼠血清抗体的产生,且随着剂量的增高,增强作用呈现一定的相关性；采用对DPPH·、O2-·、·OH、N02-自由基清除能力和还原力研究发现,5种多糖显示出不同的抗氧化活性,AAPS2清除DPPH-自由基、O2-·自由基能力最强,AAFRC清除·OH自由基的能力最强,AAFRB的清除N02-的能力最强,还原力也最强。真菌多糖的结构对其作用机制也有着不同程度的影响,真菌多糖抗肿瘤的作用方式总体可以分为两类：第1类是以细胞毒为主的直接抗肿瘤方式；第2类是以调节机体免疫为主的间接抗肿瘤方式。通过以上对5种黑木耳多糖活性的研究可知,黑木耳多糖同时具有2种抗肿瘤的作用机制,促进肿瘤细胞的凋亡,并能显著调节免疫器官活性。从其结构分析,含有β构型的多糖活性一般表现出较高的活性,含有α构型的多糖一般只有较低的活性；并且多糖的活性还表现出与分子量有一定的关系,分子量范围在200—300kDa活性最高,同时多糖的糖苷键链接方式对活性也有一定的关系,多糖中含有1→3,1→6糖苷键通常表现出较高的活性,含有1→4糖苷键则活性不高。