目的：
通过观察龟鹿二仙胶不同提取部位含药血清对豚鼠关节软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白黏多糖、Bcl-2及MMP-3的影响,从细胞、分子水平阐述龟鹿二仙胶不同提取部位对豚鼠关节软骨细胞的作用机制,筛选龟鹿二仙胶的有效部位,为龟鹿二仙胶新药的研发提供参考。
方法：
1.龟鹿二仙胶应用溶剂极性依次递增分离法,制备三氯甲烷、正丁醇、水提取物。
2. Wistar大鼠随机分组并分别用龟鹿二仙胶的3提取物连续灌胃7天后,采血制备含药血清。
3.采用三月龄豚鼠软骨细胞建立体外培养体系。
4.MTT比色法描绘各代豚鼠软骨细胞增殖生长曲线,确定各组含药血清干预时间。
5.应用免疫组化方法观察各组含药血清对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。
6.应用AJ3及PAS法观察各组含药血清对软骨细胞蛋白黏多糖表达。
7.应用RTF-QPCR法观察各组含药血清对软骨细胞bcl-2基因的表达。
8.应用ELISA法观察各组含药血清对软骨细胞MMP-3的表达。
结果：
1.甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性.提示成功建立豚鼠软骨细胞体外培养体系。
2.MTT比色法结果：各组含药血清干预软骨细胞48h促增殖药效最佳。
3.免疫组化结果：三种不同提取部位的含药血清表达均较对照组提高(P<0.05),醇提组>水提组>烷提组>对照组(P水提组>烷提组>对照组(P<0.05)。
5.阿新兰染色法(AB)结果：三种不同提取部位的含药血清阳性表达均较对照组提高(P<0.05),醇提组>水提组>烷提组>对照组(P<0.05)。
6.荧光定量PCR结果：与对照组相比,三种不同提取部位的含药血清均能显著上调bcl-2基因的表达(P<0.05)；醇提组>水提组>烷提组>对照组(P<0.05)。
7. ELISA法结果：与对照组比较,三种不同提取部位的含药血清均能明显抑制MMP-3的表达(P<0.05),抑制MMP-3的效果为：醇提组>水提组>烷提组>对照组(P<0.05)。
结论：
龟鹿二仙胶主要提取物甾体类生物激素、多糖类和脂肪酸类物质能够不同程度促进豚鼠关节软骨细胞蛋白黏多糖、Ⅱ型胶原、bcl-2基因表达,抑制MMP-3的表达,从而提高豚鼠关节软骨细胞的活性,抑制软骨细胞的凋亡,其中醇提取部位药效最佳,水提取部位次之,提示龟鹿二仙胶的醇提取部位最有可能是其有效部位。
