发酵灵芝多糖的硫酸酯化及其生物活性的研究

本文从灵芝深层发酵混合物中提取出不同组分的灵芝粗多糖，并对其进行了抑制肝癌细胞生长和抗氧化活性研究，同时对其中活性较低的组分进行了硫酸酯化修饰，希望通过合成新的多糖衍生物达到提高其抑制肝癌细胞活性的目的。选用了以氨基磺酸来修饰灵芝胞外粗多糖，考察了不同溶剂、反应温度、外加微波、超声场、催化剂等因素对生成硫酸酯化灵芝多糖衍生物的影响，并研究了它们的抑癌活性；还分析了硫酸酯化灵芝多糖抑制肝癌细胞可能存在的构效关系。主要内容包括： 1.考察了不同加热方式提取灵芝多糖： 热水浸提菌丝体多糖的提取率可达9.46mg/g菌丝体干重；微波辅助法多糖提取率可达13.02mg/g菌丝体干重；另外用超声协同提取的效果不明显； 2．考察了常规加热及微波辅助加热下胞外灵芝多糖硫酸酯化的合成工艺。通过单因素实验获得合成胞外硫酸酯化灵芝多糖的工艺条件： 常规加热条件下硫酸酯化胞外灵芝多糖的取代度可以达到1.34；微波辅助加热下硫酸酯化胞外灵芝多糖的取代度可以达到2.63； 3．考察了胞外灵芝多糖、胞内灵芝多糖和不同取代度的硫酸酯化胞外多糖（取代度1.64和取代度2.67）的抗氧化性和抑癌活性，并用流式细胞术分析了胞内多糖抑制肿瘤细胞生长的周期： 胞外灵芝多糖、胞内灵芝多糖和不同取代度的硫酸酯化胞外多糖（取代度1.64和取代度2.67）具有一定的清除DPPH自由基能力和较强的羟基自由基清除能力，而抑制络氨酸酶活能力和脂质抗氧化性能力较弱； 采用MTT法检测胞内、外多糖及其硫酸酯衍生物对不同细胞的抑制效果表明： 胞外灵芝多糖对HepG2和Bel-7404没有明显的抑制活性；胞内灵芝多糖对Huh-7、Bel-7404、HepG2、4T1、U-20S具有一定的抑制效果，对L-02、H1299没有明显的抑制作用；取代度为1.64的硫酸酯化胞外多糖取对HepG2的抑制率最高，为93.7%，而取代度为2.67的硫酸酯化胞外多糖的抑制率为64.7%；硫酸酯化胞外多糖通过与胞内灵芝 多糖复配后，其对正常肝细胞的抑制率仅为复配前的30%；通过流式细胞实验发现，胞内灵芝多糖对HepG2细胞在24h时抑制在G2/M期，细胞比例提高1倍，48h、72h时细胞周期没有明显变化；但通过补加药剂使得72h的加药组中出现了明显的凋亡峰。胞内灵芝多糖对L-02细胞周期分布影响不大。