蜜环菌多糖口服降血糖作用及其机制研究

当前,糖尿病是一个全球性的健康问题,具有较高的发病率和死亡率,由于临床治疗药物常伴有明显的副作用,寻找天然产物作为安全无毒的降血糖保健食品成为了研究热点。蜜环菌是药、食兼用真菌,多糖是其主要活性成分。研究表明,蜜环菌多糖具有抗氧化、提高免疫和降血糖等生物活性,但降血糖作用机制尚未阐明。因此,本论文拟研究蜜环菌多糖的口服降血糖作用及其机制。将蜜环菌子实体经过热水煮提、醇沉、木瓜蛋白酶和纤维素酶联合酶解得到蜜环菌总糖AMP。再利用DEAE-纤维素离子交换层析对AMP进行分离纯化,得到水洗脱的中性糖AMP-N和0.4 M NaCl洗脱的酸性糖AMP-A。运用高效液相色谱法分析单糖组成,结果表明AMP和AMP-N中葡萄糖与半乳糖的含量比为1:1,推测含有半乳葡聚糖结构域,AMP-A中葡萄糖与半乳糖的含量比为10:1,推测含有葡聚糖结构域。体外实验中,首先利用建立的高糖高脂诱导胰岛素抵抗细胞模型,比较了三种蜜环菌多糖对胰岛素抵抗的改善活性。AMP和AMP-N显示出较好的改善活性,通过激活IR-Akt-AMPK信号通路改善胰岛素抵抗,而AMP-A没有改善作用,说明半乳葡聚糖可能是其主要的活性结构域。然后利用GFP-LC3稳转细胞和人肝癌细胞,分析自噬小体和自噬相关蛋白的表达,比较了三种蜜环菌多糖诱导自噬的能力。AMP和AMP-N促进了自噬小体的形成。同时,增加了p62蛋白的降解,促使LC3-I向LC3-II的转化,说明AMP和AMP-N具有显著诱导自噬的能力。相反,AMP-A诱导自噬能力较弱。结合胰岛素抵抗改善的结果,推测AMP和AMP-N改善胰岛素抵抗可能与其诱导自噬相关。体内实验中,运用db/db糖尿病小鼠,优化了蜜环菌多糖口服降血糖的剂量和给药时间,确定最佳给药剂量为50 mg/kg/d,给药时间为4周。通过随机血糖、GTT和ITT实验,表明AMP和AMP-N具有显著的口服降血糖作用,且AMP-N的降血糖程度强于AMP,而AMP-A没有降血糖效果,这与体外改善胰岛素抵抗的结果一致。血清生化因子分析,AMP和AMP-N降低了血清甘油三酯和游离脂肪酸,说明调节了糖尿病小鼠的脂质代谢;降低了谷丙转氨酶和谷草转氨酶,说明保护了糖尿病小鼠的肝脏功能;降低了血清中胰岛素含量,说明改善了胰岛素抵抗。肝脏HE染色分析,AMP-N减少了肝脏脂滴的数量,干预了脂滴的形成,说明抑制了小鼠肝脏脂肪堆积。肝脏自噬相关蛋白表达分析,AMP-N显著增加了p62蛋白的降解,加大了LC3-I向LC3-II的转化,说明提高了小鼠肝脏的自噬水平。同时,胰岛形态分析结果显示AMP-N保护了糖尿病小鼠胰岛结构的完整性和致密性,恢复了胰岛受损的功能。此外,还分析了蜜环菌多糖的毒性。在给药期间,蜜环菌多糖对小鼠的体重、随机血糖、肝重和脂肪重量均无影响,说明蜜环菌多糖安全无毒。综上所述,蜜环菌总糖AMP和中性糖AMP-N具有显著的口服降血糖活性,且AMP-N的降血糖作用优于AMP。结合单糖组成结果,推测半乳葡聚糖可能是其主要的活性结构域。AMP-N降血糖作用的机制,一方面提高糖尿病小鼠肝脏的自噬水平,减少脂肪堆积,提高胰岛素敏感性;另一方面,保护糖尿病小鼠的胰岛,改善受损的功能。论文的结果将为蜜环菌的开发和利用奠定基础,为降血糖保健食品的研发提供依据。