背景及目的随着抗结核化疗的发展,抗结核药物所致肝损伤(ADIH)亦倍受关注。近年来国内外学者正在加速从多个角度研究ADIH的发病机制,其中亚细胞水平无疑是受关注较多的一种,他更有助于从最基础的角度来理解ADIH。肝损伤的发生是药物在肝脏的毒性代谢产物和它的解毒过程失平衡的结果。众所周知线粒体是细胞内最重要的细胞器,且哺乳动物肝细胞内含有丰富的线粒体,当结核病人服用抗结核药时势必会影响线粒体以及线粒体DNA(mtDNA)等重要的生理功能,所以我们有充足的理由相信肝细胞线粒体损伤与ADIH有着密不可分的关系。因此我们应用几种常见一线抗结核药复制小鼠肝损伤模型,从亚细胞水平详细监测了小鼠肝细胞线粒体相关指标的变化,通过研究线粒体损伤在小鼠ADIH中的作用,来探讨ADIH的发病机理,从而为广大临床医生科学、合理的使用抗结核药,实现结核病人的个体化治疗并最大限度的减少ADIH的发生提供理论依据。
方法150只昆明种小鼠随机分成5组,分别为对照组(C组)、利福平组(RFP)、异烟肼组(INH)、吡嗪酰胺(PZA)组以及三种药物的混合组(MIX)。分别按对照组0.3ml/d生理盐水、利福平135mg/kg.d、异烟肼90 mg/kg.d、吡嗪酰胺315mg/kg.d、混合组(135+90+315)mg/kg.d,每天灌胃给药一次,在用药3天、7天、15天后分批处死小鼠取标本。所有动物给药前称重,且末次给药后禁食12h。
动态观察各组:①用药前后的体重变化;②肝指数差异;③电镜观察肝细胞超微结构变化;④肝细胞线粒体丙二醛(MDA)的含量变化;⑤肝细胞线粒体超氧化物歧化酶(SOD)活力变化;⑥肝细胞线粒体谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力的变化;㈦mtDNA总甲基化水平变化;⑧mtDNA中8羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)含量的变化。
结果小鼠自身体重除对照组、PZA组和用药3天后RFP组外,其余药物组在各时间段均会造成小鼠自身体重不同程度的减轻。在小鼠肝指数变化方面,用药3天后,各用药组小鼠肝指数与对照组相比有轻微升高的趋势,但无统计学差异;用药7天后,与对照组相比,其余各组肝指数均升高,且MIX组与其余四组相比有统计学差异;用药15天后与用药7天后相似,但与对照组比较,各组肝指数升高趋势更为明显,MIX组与其余四组比较有统计学差异,另外与对照组相比,RFP组也有统计学差异。同时,随着RFP给药时间的延长,肝指数逐渐增加,与用药3天后相比,用药7天后和用药15天后均有统计学差异;随着PZA给药时间的延长,肝指数也逐渐增加,与用药3天后相比,用药15天后有统计学差异,且与用药7天后相比,用药15天后同样具有统计学差异,但INH和MIX随着用药时间的延长,肝指数变化不大。
在小鼠体重变化值方面,用药3天后小鼠体重有所降低,其中对照组与INH组相比以及MIX组与RFP相比,均有统计学差异;但用药7天后小鼠体重降低趋势减小,各组间相比均无统计学差异;用药15天后小鼠体重降低十分明显,与对照组相比其余四个用药组均有统计学差异。另外,用药3天、7天、15天后,各用药组间体重变化值均无统计学差异。
在小鼠肝细胞线粒体MDA含量方面,不同药物组间均无统计学差异。但是,随着用药时间的延长各药物组MDA含量均有不同程度的增加,其中RFP和INH相似,用药7天和15天后与用药3天后相比有统计学差异;MIX组用药15天后与用药3天后相比有统计学差异;但PZA在用药3天、7天、15天后无统计学意义。
在小鼠肝细胞线粒体SOD活力方面,用药3天后,各用药组与对照组相比有轻微降低的趋势,但无统计学差异;用药7天后,与对照组相比,RFP、IHN和MIX组有统计学差异,与PZA组相比RFP和MIX组有统计学差异;用药15天后与用药7天后相似,但PZA与IHN相比也有统计学意义。随着用药时间的延长各药物组小鼠肝脏细胞线粒体SOD活性均有不同程度的降低,RFP用药7天后和15天后与用药3天后相比有统计学差异; MIX用药15天后与用药3天后相比有统计学差异;但INH和PZA随着用药时间的延长小鼠肝脏细胞线粒体SOD活性虽有降低的趋势但变化不大。
在小鼠肝细胞线粒体GSH-PX活力方面,用药3天后,与对照组相比,RFP组、PZA组和MIX组有统计学差异;用药7天后与用药15天后相似,与对照组相比,RFP组、INH组、PZA组和MIX组均有统计学差异,但是在用药15天后,INH组与RFP组相比有统计学差异,且PZA组与RFP组相比也有统计学差异。随着用药时间的延长各药物组小鼠肝脏细胞线粒体GSH-PX活性变化无明显规律,但是RFP、INH、PZA三种药,用药7天后和15天后与用药3天后相比小鼠肝细胞线粒体GSH-PX活力有统计学差异,其中在PZA组中,用药15天后与用药7天后相比也有统计学差异。
在小鼠肝细胞mtDNA总甲基化水平方面,不同抗结核药对mtDNA总甲基化水平的影响大体上无明显规律,但用药7天后,对照组与MIX组相比有统计学差异, PZA组与MIX组相比有统计学差异。随着用药时间的延长各药物组小鼠肝细胞mtDNA总甲基化水平也没有明显的变化规律。
在小鼠肝细胞mtDNA中8-OH-dG含量方面,用药7天后和用药15天后相似,与对照组相比,其余各用药组均有统计学差异,但用药15天后, RFP组和INH组与MIX组相比也有统计学差异。随着用药时间的延长RFP、PZA、MIX三种药物组mtDNA中8-OH-dG含量逐渐增加,其中与用药3天后相比,用药7天和15天后有统计学差异,但在MIX组中,用药7天后与用药15天后相比也有统计学差异。
电镜观察线粒体发现:药物组肝细胞线粒体有不同程度的肿胀,基质疏松,嵴变短、断裂、模糊,膜不完整甚至消失以及线粒体内空泡或内容物等形态学改变。
结论抗结核药可导致小鼠肝细胞线粒体内MDA和mtDNA中8-OH-dG含量升高,SOD和GSH-PX活性降低;随着用药时间的延长损伤呈加重趋势;三种抗结核药联合用药,可加重小鼠肝细胞线粒体的损伤程度。
