玉米大斑病菌拮抗细菌筛选鉴定及发酵条件的研究

玉米大斑病是玉米上的一种重要的叶部真菌病害，给玉米生产带来了巨大的损失。长期以来，国内外对玉米大斑病的防治多采用农业防治和化学防治，防治效果不明显，并造成了一定程度的环境污染。利用拮抗微生物防治植物病害取得了比较理想的效果。因此，本研究拟从土壤中分离得到拮抗细菌，并对其进行初步的研究。 本研究从长白山和靖宇县土壤中分离纯化得到445株细菌，在PDA上进行分离初筛，得到了23株对玉米大斑病菌有着较强拮抗作用的细菌。通过摇瓶发酵后利用发酵液，采用牛津杯扩散实验进行复筛；并将发酵液和菌体分别用乙酸乙酯和甲醇进行萃取，采用滤纸片法对拮抗菌株进行进一步的复筛，获得了一株对多种病原菌有强拮抗作用的菌株CB113。通过对该菌进行形态特征和培养特征观察，生理生化的鉴定以及16S rDNA的序列分析，可以看出该菌可以利用果糖、蔗糖、D-麦芽糖，不能利用D-木糖、D-甘露醇、葡萄糖、乳糖和鼠李糖，接触酶、明胶液化和柠檬酸利用为阳性，V-P、淀粉水解、吲哚试验、苯丙氨酸脱氢酶和硝酸盐还原为阴性，牛奶石蕊试验表明该菌株产碱，并产生蛋白酶，可以将其完全胨化。将CB113菌株的16S rDNA序列提交至NCBI数据，其基于登陆号为JN007069。将序列与GenBank以及假单胞数据库中的序列进行比较，与其同源的是假单胞属（Pseudomonas spp.）细菌，与丁香假单胞（Pseudomonas syringaepv. syringae B728）和荧光假单胞（Pseudomonas fluorescens Pf-5）的同源性分别是98.99%和98.11%。结合上述特征等，初步鉴定该菌株为荧光假单胞，命名为Pseudomonas fluorescens CB113。 产荧光的假单胞能够抑制多种植物病害的发生，其主要的原因是能够产生多种的抗生素，包括吩嗪、藤黄绿菌素、吡咯菌素、2,4-二乙酰间苯三酚等。本研究运用平板检测和分子生物学检测分析了这株产荧光的假单胞菌，实验结果表明，该株细菌可以产生嗜铁素、IAA、磷酸酶和蛋白酶，可以产生吡咯菌素和非核糖体蛋白，不产生吩嗪、藤黄绿菌素和PKS。 在拮抗菌CB113的发酵条件优化中，对该菌的pH值、培养条件和时间、接种量、培养基的装瓶量、以及碳氮源等因素对抑菌活性的影响进行了研究。结果表明，该菌株pH7.0-8.0，接种量为1%，培养基装瓶量为40mL（250mL），培养温度28℃，振荡培养60h时该菌株发酵产物的抑菌活性最强。碳氮源分别为果糖和蛋白胨时最好，设计了正交实验优化了培养基配方。优化后的培养基配方为果糖25g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾2g，MgSO4.7H2O1g。 对其拮抗物进行了温度、酸碱度和紫外线三个方面的稳定性实验。当pH在5-7时，拮抗物对病原指示菌的抑菌圈变化不明显。随着温度的升高，抑菌圈直径减小，但到100℃，20min时，对病原菌的生长仍有抑制作用；紫外线照射的长短对发酵液的影响并不明显，随着紫外线照射时间的增长，该发酵液的抑菌效果并无明显的变化。结果表明该菌的拮抗物质对热、酸碱和紫外线有着较强的稳定性。