背景与目的
多药耐药(Multidrug Resistance, MDR)是肿瘤细胞由一种药物诱发后,同时对多种结构和功能不同的化疗药物产生交叉耐药的相象。肿瘤MDR的机制异常复杂,是多基因、多步骤综合作用的结果。除了主要与多药耐药基因(mu ltidrug resistance gene, mdrl)及其编码产物P.糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)所介导的经典机制外,还与凋亡相关基因(如Bcl-2,Ras,P53)等介导的非经典机制密切相关。多药耐药性目前已经成为临床肿瘤化疗失败的主要原因,如何解决这一问题是目前抗肿瘤研究的热点,其中寻找多药耐药性逆转剂或化疗增敏剂(Chemosensitizer, CS)是解决MDR问题的有效手段之一。
黄芪是常用的补益类中药,具有补气升阳,益卫固表等功效,临床常用剂型有黄芪注射液,黄芪粗制剂或以黄芪为主的复方。我们在前期研究中发现黄芪总苷对小鼠肝癌(HepA)与肉瘤(S180)具有抑瘤作用,并且体外抑制肝癌Hela细胞的生长。有报道黄芪注射液可增强肝癌耐药细胞株BEL／FU的化疗敏感性,下调P-gp表达,降低P-gp药物外排功能。黄芪皂苷II (AstragalosideⅡ,ASⅡ)和黄芪皂苷IV(Astragaloside IV,ASIV)是从黄芪总苷中分离的有效成分,药理作用广泛。黄芪总苷具有抗肿瘤及增效减毒作用,那么ASⅡ、ASⅣ是否也对肿瘤细胞具有增效减毒作用呢,目前还不不清楚也未见报道。我们旨在评价ASⅡ、AS IV对肝癌耐药细胞的逆转作用,并从mdr1、Bax、Bcl-2基因水平和P-gp蛋白表达量探讨逆转耐药的作用机制。
方法1.70%乙醇回流提取,水饱和正丁醇萃取,D101大孔吸附树脂富集纯化黄芪总苷,硅胶柱层析分离不同的皂苷组分。
2.薄层色谱法、高效液相—示差检测器法分别进行皂苷类成分的鉴定及含量测定。
3.选择人肝癌敏感细胞株BEL-7402、肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU做为实验细胞,采用MTT法测定细胞株对三种化疗药物(5-FU、ADR、MMC)的敏感性和耐药倍数。
4.MTT比色法测定(0.04,0.08,0.16,0.32,0.64)mg/mL的ASⅡ及f0.04,0.08,0.16,0.32,0.64)mg/mL的ASⅣ对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的剂量效应曲线,并根据上述实验结果确定逆转耐药剂量。
5.选择无细胞毒作用的ASⅡ、ASⅣ剂量作用BEL-7402/5-FU细胞,MTT法检测细胞存活率,求出逆转倍数。
6. RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测mdrl mRNA表达和P-gp蛋白表达。
7.流式细胞仪检测ASⅡ、AS IV对细胞内Rho123的蓄积影响及细胞凋亡。
8.采用RT-PCR检测Bax, Bcl-2mRNA表达。
结果1.从黄芪总苷中分离出六种化合物(AS-Ⅰ～AS-Ⅵ),其中AS.Ⅰ部分经鉴定主要含黄芪皂苷Ⅱ,含量为29.4%,AS-Ⅲ部分经鉴定主要含黄芪皂苷Ⅳ,含量为22.82%。其余4个部分有待于进一步鉴定。
2. BEL-7402/5-FU细胞对5-FU、ADR, MMC三种化疗药物均显示耐药性,耐药倍数分别为19.64,1.98,1.92。
3. AS II (0.04,0.08mg/mL)、ASIV(0.04,0.08 mg/mL)能够提高5-FU对BEL-7402／5-FU的细胞毒作用,ASⅡ逆转倍数为1.49,1.81,ASⅣ逆转倍数为1.70,1.86。
4. (0.08,0.16)mg/mL的ASⅡ作用BEL-7402／5-FU细胞后,BEL-7402组、BEL-7402／5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU+ASⅡ组mdrl/GAPDH比值分别为0.219±0.03,0.367±0.08,0.568±0.09,0.321±0.06,0.116±0.01；而(0.08,0.16)mg/mL的ASⅣ作用细胞后,BEL-7402/5-FU+5-FU+ASⅣ组mdrl/GAPDH比值分别为0.200±0.03,0.148±0.02。
5.光学显微镜下观察,P-gp蛋白阳性反应呈棕黄色,主要位于胞质中,呈细颗粒状均匀分布,其中耐药细胞BEL-7402/5-FU组表达增加,颜色加深,表达率为(0.566±0.02)%,经(0.08,0.16)mg/mL的ASⅡ作用的耐药细胞P-gp蛋白表达率为(0.401±0.02)%,(0.319±0.01)%；经(0.08,0.16)mg/mL的ASⅣ作用后,耐药细胞P-gp蛋白表达率为(0.364±0.02)%,(0.287±0.01)%,颜色变浅,胞质内棕黄色颗粒明显减少。
6.在Rho123外排实验中,BEL-7402/5-FU细胞内Rho123荧光很弱,加(0.08,0.16)mg/mL的ASⅡ、ASⅣ作用后,波峰右移,细胞内荧光明显增强。
7. RT-PCR结果显示,(0.08,0.16)mg/mL的ASⅡ作用BEL-7402/5-FU细胞后,BEL-7402组、BEL-7402/5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU+ASⅡ组Bax/Bcl-2 mRNA比值为0.727±0.11,0.501±0.07,0.439±0.07,0.856±0.05,0.993±0.08；而(0.08,0.16)mg/mL的ASⅣ作用细胞后,BEL-7402/5-FU +5-FU+ASIV组Bax/Bcl-2 mRNA比值分别为0.580±0.09,1.259±0.03。
8.不同浓度的ASⅡ和ASⅣ,均能促进BEL-7402/5-FU和BEL-7402细胞的DNA亚G1峰升高。经流式细胞仪随机软件分析表明,(0.08,0.16,0.32)mg/mL的ASⅡ作用细胞后,BEL-7402/5-FU和BEL-7402细胞的凋亡率分别为(2.75±0.25)%,(4.75±0.25)%,(6.05±0.21)%,(5.95±0.35)%,(9.3±0.2)%,(14.8±0.42)；(0.08,0.16,0.32)mg/mL的ASⅣ作用细胞后,BEL-7402/5-FU和BEL-7402细胞的凋亡率分别为(3.15±0.29)%,(4.90±0.35)%,(7.85±0.21)%,(4.5±0.1)%,(6.95±0.17)%,(19.1±0.2)%,P<0.01。与不加药的细胞对照组相比有统计学差异。
结论采用醇提,D101大孔吸附树脂富集纯化总皂昔,硅胶柱层析分离皂苷的方法,能很好的分离和纯化黄芪皂苷；ASⅡ和ASⅣ能够部分逆转BEL-7402/5-FU细胞的耐药性,其机制可能与下调mdrl mRNA表达及抑制P-gp的表达与功能,同时与上调Bax/Bcl-2 mRNA比例,促进细胞凋亡有关。
