LepR基因缺陷与外源雌激素刺激导致小鼠成年后生殖障碍的研究

随着经济的发展和社会的进步,肥胖已经成了普遍影响人类健康的因素,可以引发很多疾病,如心血管疾病、糖尿病等；同时,影响人类的生育能力,造成生育障碍甚至不孕不育。瘦素是1994年确认发现的肥胖基因(ob基因)表达产物,具有调节体重和脂肪分布的作用,与肥胖和生殖有密切的关系。多囊卵巢综合症(PCOS)患者不仅多伴有肥胖发生,而且不能正常排卵,甚至是不能生育。一部分PCOS患者体内检测到瘦素或者受素受体基因缺陷,而且这类患者普遍存在受素抵抗的症状。在动物模型中已证实瘦素缺陷小鼠(ob/ob)和瘦素受体缺陷小鼠(db/db)均表现异常肥胖且不孕不育。为了进一步研究瘦素与不孕不育的关系,本研究采用与db/db小鼠类似的瘦素受体缺陷Y123F小鼠模型,该小鼠模型的瘦素受体Ob-Rb胞内区域3个关键酪氨酸位点突变为苯丙氨酸,导致这三个位点介导的下游信号通路被阻断。该小鼠模型成年雌性不育,且体重因脂肪积累而异常增高,其模型更接近人类的病理特性,因此是研究肥胖与不育理想对象。 本研究首先通过形态学观察,与野生型小鼠相比,Y123F纯合型小鼠体重和腹部脂肪显著增多,但是卵巢和子宫的质量则明显降低。组织学表型分析发现,卵巢只有三级卵泡,没有成熟卵泡和黄体,提示Y123F纯合型小鼠不能正常排卵；子宫内膜的基质和上皮以及腺体退化,基质层出现一些明显的空腔。通过连续12天观察,10周小鼠阴道涂片上皮细胞检查结果发现Y123F纯合型小鼠没有明显的动情周期,外周血清中雌激素浓度的测定结果也支持这个结果。挑选脂肪合成代谢密切相关基因PPARgamma进行RT-PCR检测和Western-blot检测结果表明PPARgamma在Y123F纯合型小鼠卵巢、子宫中mRNA和蛋白的表达水平均比野生型小鼠低,借助免疫组化,发现PPARgamma蛋白在Y123F纯合型小鼠和野生型小鼠的颗粒细胞和发育的卵母细胞膜均有表达,但是在Y123F纯合型小鼠颗粒层细胞上的表达少,推测与瘦素受体缺陷引起的卵巢组织细胞的脂质化相关。 基因芯片技术有助于筛选三组小鼠卵巢子、宫中变化最显著的基因。截至目前,Y123F小鼠的卵巢、子宫基因表达谱变化还未见研究报道。本研究比较了Y123F纯合型、杂合型和野生型小鼠卵巢和子宫的microRNA表达谱,发现Y123F纯合型小鼠与野生型小鼠卵巢和子宫组织存在表达谱差异,卵巢中有179个、子宫有4701个基因表达呈现显著差异；杂合型小鼠与野生型小鼠之间mRNA表达差异的基因减少很多,卵巢中有75个、子宫有1921个基因具有显著差异。这些表达差异基因涉及许多已知的代谢通路,在Y123F纯合型小鼠包括卵巢中41个、子宫中173个信号通路；在Y123F杂合型小鼠包括卵巢中的15个、子宫中的139个信号通路。设计与脂肪代谢、激素合成等相关基因的引物,如Leptin、Prlr、Gadd45a、Gadd45b、 Jun、Gadd45g、Fabp3、Acsl4、Foxa3、Cish,利用RT-PCR和实时定量PCR技术验证芯片结果,发现受素受体缺陷引起小鼠卵巢、子宫功能异常是涉及到多个基因相互作用的结果。 雌激素对维持卵巢和子宫正常功能起关键作用。Y123F纯合型小鼠外周血清中雌激素含量降低,而且芯片结果也显示其在子宫、卵巢中涉及雌激素受体信号通路有基因表达变化。同时有文献报道,经雌激素过量刺激的小鼠卵巢也出现人类PCOS类似症状。据报道大豆肽对抑制食欲和营养物吸收有一定作用。在本研究的第三部分用过量雌激素刺激性成熟前小鼠,再连续灌大豆肽,以水作对照,并与Y123F纯合型小鼠作对比研究。性成熟前过量雌激素刺激的小鼠,12周龄时与对照组相比,虽然体重没有增加,但是卵巢和子宫形态发生很大变化,卵巢增大、三级卵泡增多,但是没有黄体,推测不能正常排卵；子宫则明显肿大,子宫内膜基质增生,基质中可见大量的血管侵润；外周血中的雌激素含量明显升高。大豆肽虽然能降低Y123F纯合型小鼠的体重,但无论对于雌激素过量刺激的小鼠还是Y123F纯合型,对改善模型小鼠外周血雌激素浓度,而对于卵巢和子宫组织形态无明显作用。