脓毒症血清细胞因子与肝脏功能及其线粒体损伤的相关性研究

目的 脓毒症(sepsis)是感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),其本质是大量细胞因子和炎症介质释放导致的宿主自身免疫性损伤,进一步发展可导致脓毒症休克、多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等严重的并发症。虽然有抗生素的广泛应用,但MODS的死亡率仍然很高,是危重病医学领域的难题。随着分子生物学的快速发展,人们已逐步认识到,机体对感染的反应最终表现在细胞、组织、器官和整体层次上。肝脏是机体进行物质和能量代谢的重要器官,且脓毒症早期肝脏功能及其线粒体极易受损伤。因此本课题通过检测和观察脓毒症大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平变化和肝脏功能、形态及其线粒体变化,从而研究脓毒症大鼠血清细胞因子水平与肝脏功能及其线粒体损伤的相关性,探讨血清细胞因子水平对肝脏功能及其线粒体损伤可能的机制,为预防和诊治脓毒症肝脏损伤提供实验参考。 方法 1.建立动物模型及分组 脓毒症模型采用腹腔注射10mg/kg LPS建立。80只无特定病原体(Specefic Pathogen Free,SPF)级SD雄性大鼠随机分为8组:正常对照组(n=10):腹腔注射等容量的生理盐水;实验组(n=70):分为LPS注射后3、6、12、24、36、48、72小时7个时间点,每个时间点10只(n=10),腹腔注射LPS10mg/kg。 2.检测指标及方法 2.1大鼠一般情况观察正常对照组大鼠和注射LPS后3h、6h、12h、24h、36h、48h和72h组大鼠的精神状态、有无腹泻、竖毛、皮肤粘膜出血的情况,并测量肛温、心率和呼吸频率,检测血浆LPS水平。 2.2大鼠炎症反应指标运用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测正常对照组大鼠和注射LPS后3h、6h、12h、24h、36h、48h和72hLPS组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10和MBL的浓度水平。 2.3大鼠肝功能指标肝功能指标:运用全自动生化分析仪检测大鼠血清ALT、AST、LDH、TG、HDL和LDL水平。 2.4大鼠肝脏组织病理切片观察 2.5大鼠肝脏组织切片凋亡原位末端标记检测凋亡率采用TUNEL法进行检测。 2.6大鼠肝脏组织粒体损伤相关指标采用差速离心法提取大鼠肝脏线粒体,JC-1染料染色,流式细胞仪检测线粒体肿胀程度和线粒体膜电位。电镜观察大鼠肝脏线粒体损伤状况,按照Flameng分级方法对线粒体进行半定量评分。 3.统计方法获得的数据SPSS13.0统计软件分析,结果用均值±标准差(±s)表示;多组间比较采用单因素方差分析,在多样本均数比较差异具有统计学意义时进行均数两两比较,方差齐性者采用LSD法分析组间差异,方差不齐者采用Games-Howell法分析组间差异;重复测量资料采用重复测量方差分析;相关分析采用Pearson进行检验;α值界定为0.05。 结果 1.动物一般情况 1.1与正常对照组相比,LPS-3h、LPS-6h、LPS-12h、LPS-24h组呼吸、心率显著升高(P<0.05),以LPS-6h升高最明显,LPS-36h、LPS-48h、LPS-72h组大鼠呼吸心率与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。 1.2与正常对照组相比,注射LPS各组大鼠血浆LPS水平均显著升高(P<0.05)。 2.大鼠炎症反应指标 2.1各组大鼠血清TNF-α水平的比较腹腔注射LPS后3h、6h、12h和72h组与正常对照组相比,大鼠血清TNF-α水平显著升高(P<0.05),以LPS-3h组血清TNF-α水平升高最为显著,LPS-24h和LPS-36h组血清TNF-α水平与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。 2.2各组大鼠血清IL-6水平的比较腹腔注射LPS后3h、6h、12h和24h组与正常对照组相比,大鼠血清IL-6水平显著升高(P<0.05),以LPS-3h组血清IL-6水平升高最为显著, LPS-36h、LPS-48h和LPS-72h组血清IL-6水平与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。 2.3各组大鼠血清IL-10水平的比较腹腔注射LPS后3h、6h、12h、24h、36h和48h组与正常对照组相比,大鼠血清IL-10水平显著升高(P<0.05),以LPS-6h组血清IL-10水平升高最为显著,LPS-72h组血清IL-10水平与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。 3.大鼠肝脏生化指标 各组大鼠血清ALT、AST和LDH水平的比较 腹腔注射LPS后3h、6h组与正常对照组相比,大鼠血清ALT、AST和LDH水平显著升高(P<0.05)。以LPS-6h组血清ALT、AST和LDH水平升高最为显著。LPS-72h组血清AST和LDH水平与正常对照组相比差异明显(P<0.05)。 4.大鼠肝脏组织切片凋亡率 腹腔注射LPS后6h、12h、24h和36h组与正常对照组相比,大鼠肝脏组织切片凋亡率显著升高(P<0.05),以LPS-12h组肝脏组织凋亡率升高最为显著,LPS-48h、LPS-72h组肝脏组织凋亡率与正常对照组相比无明显差异(P>0.05) 5.1各组大鼠肝脏线粒体肿胀程度和膜电位的比较腹腔注射LPS后各组大鼠间肝脏线粒体肿胀程度的比较差异不明显,不具有统计学意义(P>0.05)。 腹腔注射LPS后3h、6h、12h、24h、36h和48h组与正常对照组相比,大鼠肝脏细胞线粒体膜电位水平显著降低(P<0.05),以LPS-24h组肝脏线粒体膜电位降低最为明显(P<0.05),LPS-72h组线粒体膜电位与与正常对照组相比无明显差异(P>0.05) 5.2各组大鼠肝脏线粒体电镜观察及半定量分析腹腔注射LPS后12h、24h、36h和48h组与正常对照组相比,各组大鼠肝脏线粒体电镜半定量评分显著上升(P<0.05),以LPS-24h组线粒体半定量评分上升最为显著,LPS-72h组线粒体半定量评分与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。 6.大鼠各指标的相关性分析 大鼠血清TNF-α水平与血清ALT、AST和LDH水平呈具有显著统计学意义的正相关,相关系数分别为0.475(P<0.05)、0.533(P<0.05)和0.633(P<0.05)。 大鼠血清IL-6水平与血清ALT、AST和LDH水平呈呈具有显著统计学意义的正相关,相关系数分别为0.42(P<0.05)、0.52(P<0.05)和0.394(P<0.05)。 大鼠血清IL-10水平与血清ALT和AST水平的变化呈具有显著统计学意义的正相关,相关系数分别为0.301(P<0.05)和0.278(P<0.05);与血清LDH水平的变化无明显相关性,相关系数为0.099(P>0.05)。 大鼠肝脏线粒体膜电位与血清ALT、AST和LDH水平的变化无明显性相关性,相关系数分别为0.042(P>0.05)、0.007(P>0.05)和0.182(P>0.05)。 大鼠肝脏线粒体膜电位与血清IL-6和IL-10水平的变化呈具有显著统计学意义的负相关,相关系数分别为-0.451(P<0.05)和-0.721(P<0.05);与血清TNF-α水平的变化无明显相关性,相关系数为-0.1(P>0.05)。 结论 1.脓毒症血清TNF-α、IL-6和IL-10水平呈时相性变化,其峰值时间早于肝脏功能、形态及肝脏线粒体损伤时间。 2.脓毒症血清TNF-α水平呈双峰性改变,说明可能与机体存在二次打击相关。 3.脓毒症时血清TNF-α、IL-6和IL-10水平与肝脏功能损伤呈正相关,提示血清TNF-α、IL-6和IL-10水平升高可能是肝脏功能损伤的因素。 4.脓毒症肝脏线粒体具有可逆性,其膜电位与血清IL-6和IL-10水平呈负相关,提示血清IL-6和IL-10水平升高可能是肝脏线粒体功能损伤的因素。