通心络干预大鼠心肌缺血再灌注损伤的自噬机制及其相关microRNA途径

目的:本研究从自噬角度探索通心络对心肌细胞的保护机制,并筛选潜在的目标microRNA,以期为临床治疗提供新的药物靶点。方法:实验一 105只Sprague-Dawley(SD)雄性成年大鼠造模满70只后随机分为7组:假手术组、模型组、通心络低剂量组(0.5g/kg/d)、通心络高剂量组(1g/kg/d)、阳性药阿托伐他汀组(7.2mg/kg/d)、氯喹(10mg/kg/d)组、通心络高剂量+氯喹(10mg/kg/d)组,每组10只大鼠。通过预给药7天后进行冠状动脉左前降支结扎50min再灌注4h制备心肌缺血再灌注损伤动物模型(假手术组只穿线不结扎),通过检测心电图、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数、心肌酶学指标等判定通心络对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。通过透射电镜观察缺血区心肌组织的微血管内皮形态和自噬体并通过Western blot检测自噬蛋白LC3、p62、Beclin1以及线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin和泛素蛋白Ubiquitin等判定通心络对自噬的干预效果和线粒体自噬途径。实验二 运用microRNA芯片技术对实验一大鼠模型组和通心络高剂量组进行筛选microRNA的表达变化,并通过qPCR技术验证差异表达的microRNA。通过microRNA mimics过表达转染大鼠H9c2心肌细胞,在细胞水平通过缺氧4h/复氧4h模拟在体缺血再灌注损伤模型,运用CCK8、LDH、流式细胞仪等方法检测过表达目的microRNA对心肌细胞的表型作用;运用激光共聚焦显微镜检测对心肌细胞自噬流的影响,通过生物信息学方法结合已报道文献预测目的microRNA的靶基因。结果:实验一1.大鼠心肌缺血再灌注损伤模型组造模成功,各组大鼠在结扎后心电图均有明显ST段改变,且伴随心率加快;再灌注后ST段稍有变化,可伴有T波倒置等表现;再灌注4h后各组大鼠心电图ST段均有不同程度回落。2.假手术组未见心肌梗死和明显的心肌细胞凋亡,心肌酶cTnI表达正常。模型组具有明显的心肌梗死区域且梗死面积与假手术组相比有明显差异(P<0.01),心肌细胞的凋亡指数明显上升(P<0.01),心肌酶cTnI表达升高(P<0.01);通心络高剂量组与模型组相比,心肌梗死面积明显减少(P<0.05),心肌凋亡指数和心肌酶cTnI表达降低,具有统计学意义(P<0.05);阿托伐他汀组与模型组相比,心肌梗死面积、心肌凋亡指数和心肌酶cTnI表达具有明显统计学差异(P<0.05),且效果与通心络高剂量组相当;氯喹组与模型组相比,心肌梗死面积、心肌凋亡指数和心肌酶cTnI表达明显增加(P<0.05),通心络高剂量+氯喹组与通心络高剂量组相比,心肌梗死面积和心肌凋亡指数均明显增加(P<0.05),心肌酶cTnI表达升高(P>0.05)。3.假手术组心肌细胞微观结构未见有明显异常;模型组和假手术组相比,心肌细胞和心肌微血管内皮细胞微观结构紊乱,线粒体肿胀、分裂,线粒体内外膜间隙增宽,自噬体较多而明显(P<0.05);通心络高剂量组和阿托伐他汀组与模型组相比,均能改善心肌细胞线粒体结构和心肌微血管内皮细胞微观结构,且自噬体数量较多(P<0.05);氯喹组与模型组相比,心肌细胞微观结构明显混乱,线粒体崩解、分裂;通心络高剂量+氯喹组与通心络高剂量组相比,心肌细胞微观结构未见明显改变。4.假手术组的自噬蛋白LC3、p62、Beclin1表达水平较低,与之相比,模型组的自噬蛋白LC3、p62表达明显升高(P<0.05),Beclin1蛋白表达上调,没有统计学差异(P>0.05);通心络能够剂量依赖性地增加LC3(P<0.05)、p62(P<0.05)、Beclin1(P>0.05)蛋白表达水平,其效果与阿托伐他汀相当。而氯喹组与模型组相比,自噬蛋白明显下调(其中Beclin1(P>0.05)),通心络高剂量+氯喹组与通心络高剂量组相比,LC3、p62、Beclin1表达均有下降,但无统计学差异(P>0.05)。5.假手术组的PINK1、Parkin蛋白和Ubiquitin蛋白均有少量表达,模型组与假手术组相比,三者均具有较明显升高(P<0.05);与模型组相比,通心络高、低剂量组均能增加PINK1、Parkin蛋白表达(P<0.05),而减少Ubiquitin蛋白(P<0.05),其中通心络高剂量组和阿托伐他汀均能使PINK1、Parkin蛋白相较于模型组有明显升高(P<0.05),Ubiquitin蛋白则无明显差异(P>0.05)。6.VEGF在模型组中比假手术组表达明显增多(P<0.05),通心络高剂量组与模型组相比,其表达量明显升高(P<0.05);阿托伐他汀组则与模型组相比没有明显升高(P>0.05)。实验二1.通过microRNA芯片筛选和qPCR验证,miR-450a-5p,miR-532-5p,miR-193a-3p在通心络高剂量组相较于模型组具有明显上调(P<0.05),且表达趋势与芯片一致。2.大鼠H9c2心肌细胞缺氧4h/复氧4h能够引起明显的细胞活力减弱(P<0.05),LDH释放增加(P<0.05),流式凋亡增加(PP<0.05),而转染miR-450a-5p,miR-532-5p,miR-193a-3p均能增加细胞活力,减少LDH释放和凋亡,具有明显统计学差异(P<0.05)。3.转染miR-450a-5p,miR-532-5p mimics能够增加其表达量,提升细胞内的自噬流水平(P<0.05)。4.结合生物信息学预测和既往文献报道推测miR-532-5p,miR-450a-5p均与心肌缺血缺氧有关,其中PDCD4、TP53可能是通心络通过miR-532-5p或miR-450a-5p保护心肌细胞的靶基因。结论:1.心肌缺血再灌注损伤模型组造成明显的心肌损伤,高剂量通心络预给药能够缓解心肌缺血再灌注损伤,保护心肌细胞;2.通心络缓解心肌缺血再灌注损伤和调控心肌细胞自噬水平密切相关;3.通心络通过PINK1/Parkin线粒体自噬通路清除损伤线粒体,并和泛素蛋白酶体系统协同处理错误折叠蛋白的降解,维持胞内平衡,保护心肌细胞;4.miR-450a-5p和miR-532-5p可能是通心络保护缺血心肌的靶microRNA,PDCD4、P53可能是通心络通过miR-532-5p或miR-450a-5p缓解心肌缺血再灌注损伤的靶基因。