TRPC6在足细胞损伤中的作用研究

第一部分 足细胞损伤时TRPC6表达的变化及TRPC6高表达对裂孔隔膜蛋白及细胞骨架的影响 目的：观察PAN作用下体外培养的小鼠足细胞TRPC6分布以及表达的变化，进一步研究TRPC6高表达对足细胞裂孔隔膜分子Nephrin及细胞骨架成分α-actinin-4和α-tubulin的影响。 方法：在33℃许可条件下培养的小鼠足细胞传代后转入37℃非许可条件下继续培养14天，以不同浓度（10μg／ml，30μg/ml，50μg／ml，70μg／ml）、不同时间（6小时，12小时，24小时，48小时）PAN处理足细胞，分别应用免疫荧光技术观察TRPC6分布的变化；用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR）及Western印迹方法分别检测TRPC6 mRNA及蛋白水平的变化。用脂质体法将小鼠TRPC6真核表达载体pEGFP-N1-mTRPC6转染足细胞，48小时后用荧光显微镜观察EGFP的表达；48小时后Western印迹方法检测转染后TRPC6蛋白表达的变化；应用免疫荧光技术观察转染后Nephrin、α-actinin-4、α-tubulin分布的变化；用RT-PCR及Western印迹方法分别检测Nephrin、α-actinin-4、α-tubulin mRNA及蛋白水平的变化。 结果：成熟足细胞TRPC6主要分布于细胞核周围和细胞膜，PAN作用24小时后足细胞上TRPC6分布出现变化，细胞膜上分布明显增强，48小时后变化更加明显。PAN作用于足细胞后，TRPC6 mRNA及蛋白表达水平明显升高，并呈现剂量依赖性和时间依赖性，在30μg／ml PAN作用下，TRPC6的表达即明显升高（P＜0．05），当更高浓度PAN作用时，TRPC6的增高更加明显（P＜0．01）；应用50μg／ml PAN时，在12小时TRPC6 mRNA及蛋白表达开始上调（P＜0．05）并随作用时间的延长逐渐增高。pEGFP-N1-mTRPC6转染足细胞后约35％细胞出现绿色荧光；足细胞TRPC6蛋白表达水平明显增高（P＜0．01）。转染TRPC6以后Nephrin、α-actinin-4分布均出现变化；Nephrin在mRNA及蛋白水平分别下降42%及26%左右（P＜0．05）；α-actinin-4在mRNA及蛋白水平分别下降22%及25%左右（P＜0．05）；TRPC6高表达对α-tubulinmRNA及蛋白水平无影响，但可影响其分布。 结论：在PAN作用于足细胞导致其损伤后，TRPC6分布出现变化并且其表达增高；TRPC6高表达干扰了足细胞裂孔隔膜分子Nephrin以及细胞骨架蛋白α-actinin-4、α-tubulin的正常定位及功能。 第二部分 TRPC6在AngⅡ诱导的小鼠足细胞凋亡过程中的作用 目的：研究TRPC6高表达对AngⅡ诱导的小鼠足细胞凋亡的影响并初步探讨其作用机制。 方法：在33℃许可条件下培养的小鼠足细胞传代后转入37℃非许可条件下继续培养14天，四甲基偶氮唑盐法（MTT法）检测不同浓度AngⅡ对足细胞活性的影响；用脂质体法将针对小鼠TRPC6的基因真核表达载体pEGFP-N1-mTRPC6转染体外培养的永生化小鼠足细胞系，同时转染pEGFP-N1空载体作为对照，48小时后用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达，Western印迹方法检测转染后TRPC6蛋白表达的变化；应用AngⅡ(10-6mol／L)处理足细胞，Fluo-3AM结合激光共聚焦显微镜观察转染TRPC6基因后足细胞胞浆内钙离子浓度的变化；将细胞分组，分别采用低剂量(10-10mol／L)及高剂量(10-6mol／L)AngⅡ刺激细胞，24小时后用逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）及Western印迹方法分别检测Bax、Bcl-2mRNA及蛋白水平的变化；流式细胞仪及Hoechst33258染色法检测足细胞凋亡。 结果：低剂量AngⅡ(10-10mol／L)作用24小时，对足细胞活力无影响；高剂量AngⅡ(10-6mol／L)作用24小时后足细胞活力下降约50％；pEGFP-N1-mTRPC6转染足细胞后约35％细胞出现绿色荧光，足细胞TRPC6蛋白表达水平明显增高（P＜0．01）；转染TRPC6以后可以明显促进AngⅡ诱导的足细胞钙离子内流（P＜0．01）；低剂量AngⅡ(10-10mol／L)作用24小时后，与对照组相比，Bax、Bcl-2mRNA及蛋白的表达无明显变化；转入TRPC6基因后，Bax mRNA及蛋白表达水平明显增高（P＜0．01）而Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平明显下调（P＜0．05）；高剂量AngⅡ(10-6mol／L)作用24小时可上调Bax的表达而下调Bcl-2的表达（P＜0．01），转染TRPC6基因则Bax的表达进一步升高而Bcl-2的表达进一步下降（P＜0．01，P＜0．05）；在低剂量AngⅡ(10-10mol／L)作用下，足细胞凋亡率为（2．50±0．72）％，转染TRPC6以后凋亡率为（4．33±0．45）％（P＜0．05）；在高剂量AngⅡ(10-6mol／L)作用下，足细胞凋亡率为（15．46±1．40）％，转染TRPC6以后凋亡率为（18．33±0．87）％（P＜0．01），转染pEGFP-N1空载体对凋亡率则无影响。 结论：TRPC6在AngⅡ诱导的足细胞凋亡中发挥重要作用；TRPC6可能通过增加钙离子内流，进而启动其下游的凋亡调节成分参与凋亡过程。 第三部分 TRPC6 shRNA真核表达质粒的构建及其对足细胞损伤的影响 目的：构建针对TRPC6基因的短发夹结构RNA（shRNA）真核表达质粒，观察基因敲低TRPC6对PAN诱导的小鼠足细胞损伤的影响。 方法：设计两条针对TRPC6mRNA不同靶序列的干扰序列，将其插入真核表达质粒pGCsi-U6-Neo-GFP-shRNA，构建针对TRPC6基因的shRNA表达载体pGCsi-TRPC6A和pGCsi-TRPC6B，经酶切和DNA测序证实；选择不与任何基因同源的序列NC作为阴性对照；用脂质体法将构建成功的3种重组质粒转染体外培养的永生化小鼠足细胞系。24及48小时后用荧光显微镜观察GFP的表达；48小时后RT-PCR法和Western印迹法检测TRPC6的干扰效率。将细胞分为4组：正常对照组、PAN干预组、PAN干预+转染pGCsi-TRPC6B组以及PAN干预+转染pGCsi-NC组。PAN作用48小时后应用Western印迹法检测Nephrin、CD2AP表达的变化，应用RT-PCR及Western印迹法分别在mRNA及蛋白水平检测Bax、Bcl-2表达的变化；应用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。 结果：应用质粒提取试剂盒抽提重组质粒pGCsi-TRPC6A及pGCsi-TRPC6B后进行测序分析，基因测序结果证明插入到pGCsi-U6-Neo-GFP-shRNA的序列与设计的序列完全一致，符合设计要求；小鼠足细胞转染shRNA24小时后，GFP的表达率为45％左右；pGCsi-TRPC6A及pGCsi-TRPC6B均下调了TRPC6 mRNA及蛋白的表达（P＜0．05），但pGCsi-TRPC6B作用较pGCsi-TRPC6A更强，因此后续实验采用pGCsi-TRPC6B；PAN作用48小时后Nephrin及CD2AP表达明显下调，PAN干预+转染pGCsi-TRPC6B组Nephrin及CD2AP下降不明显（P＜0．05），PAN作用48小时后在mRNA及蛋白水平均上调了Bax的表达而下调了Bcl-2的表达；转染TRPC6shRNA质粒后可明显逆转上述改变（P＜0．05）；基因敲低TRPC6可以明显降低PAN诱导的足细胞凋亡率（P＜0．05）。 结论：成功构建了针对TRPC6基因的shRNA真核表达质粒，转染足细胞后能发挥确切的RNA干扰作用使TRPC6基因沉默；基因敲低TRPC6能有效保护PAN诱导的足细胞损伤。