多次小剂量LPS处理减轻慢性肝损伤的机制研究

内毒素(endotoxin, ET)主要的毒性成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),是革兰氏阴性(Gˉ)细菌细胞壁上的主要成份,也是Gˉ细菌最为重要的致病物质,可激活单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagocytic system, MPS)引起肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白三烯(leukotriene)等细胞因子、炎症介质大量释放,导致肝损伤甚至是肝功能衰竭的发生,而机体或细胞经小剂量LPS处理后所诱导的内毒素耐受(endotoxin tolerance,ETT)则对LPS的再次刺激呈低反应性。目前认为,内毒素耐受是生物在长期进化过程中形成的一种负反馈调节机制,是一种适应性应答,能避免机体对LPS刺激的持续过度反应,是机体防御机制的重要组成部分。这就提示如能调动机体的内源性抗损伤机制,使其在随后受到细菌或毒素感染时,即能发挥抗感染的有益作用,又不致于引发过度炎症反应,无疑对肝损伤的防治具有重要作用。我所诸多动物实验和临床研究发现,各种慢性肝炎、肝硬化动物和患者均伴有肠源性内毒素血症(IETM),有报道认为,小剂量LPS处理可以减轻急性肝损伤,而多次小剂量LPS处理与慢性肝损伤的关系及机制国内外报道尚属罕见,值得进一步研究。 本论文共分两部分。第一部分：多次小剂量LPS处理对CCl4诱导的慢性肝损伤的影响及其相关信号分子的变化；第二部分：多次小剂量LPS处理对非酒精性脂肪性肝炎发生发展的影响及其机制研究。 第一部分探讨多次小剂量LPS处理对CCl4诱导的慢性肝损伤的影响及其相关信号分子的变化 实验一多次小剂量LPS处理对CCl4诱导的慢性肝损伤的影响 选取雄性Wistar大鼠34只,随机分为正常对照组、肝损伤组和LPS处理组。肝损伤组经皮下注射CCl4并同时饲以高脂饮食诱导慢性肝损伤,LPS处理组经腹腔注射小剂量LPS,余同肝损伤组。实验第4周末大鼠在1%戊巴比妥钠麻醉下,无菌无热原条件下取腹主动脉血,用于测定内毒素水平和ALT活性；取肝组织测定TNF-α水平；制备肝脏切片,观察肝脏病理改变。结果：肝损伤组血浆内毒素水平、ALT活性、肝匀浆TNF-α水平均明显高于正常对照组；而经小剂量LPS处理后血浆ALT活性、肝匀浆TNF-α水平显著低于肝损伤组；肝组织切片HE染色结果发现,肝损伤组肝细胞出现严重的脂肪变性,可见细胞核被挤压在细胞边缘；肝组织内可见肝细胞点状及灶状坏死,坏死区有以淋巴细胞为主的慢性炎细胞浸润；而LPS处理组肝细胞内脂肪空泡以小空泡为主、数量少,肝脂肪变性明显减轻,同时肝组织淋巴细胞浸润少。经统计学处理后提示CCl4所致肝损伤伴有肠源性内毒素血症；经多次小剂量LPS处理可以减轻肝损伤。 实验二TLR4在多次小剂量LPS处理减轻CCl4诱导的慢性肝损伤中的作用 本部分实验采用Western blotting测定各组肝组织中TLR4表达。实验动物同实验一。结果表明,肝损伤组TLR4表达与正常对照相比,明显增强；经多次小剂量LPS处理后肝组织中TLR4表达明显下调,与肝损伤组相比差异有显著性。 实验三在多次小剂量LPS处理减轻CCl4诱导的慢性肝损伤中p38MAPK的表达 该实验采用Western blotting观察各组肝组织中p38MAPK表达的变化。实验动物同实验一。结果显示,各组总p38MAPK表达一致,而pp38MAPK在肝损伤组的表达明显增强,经多次小剂量LPS处理后,显著减弱。 实验四在多次小剂量LPS处理减轻CCl4诱导的慢性肝损伤中NF-κB与IκB的表达 该实验主要采用Western blotting观察各组肝组织中NF-κB与IκB表达的变化。实验动物同实验一。结果：肝损伤组与正常对照组相比,NF-κB表达明显增强,IκB表达明显减弱；而LPS处理组NF-κB表达明显减弱,IκB表达明显增强。 实验五在多次小剂量LPS处理减轻CCl4诱导的慢性肝损伤中IRAK-M的表达 该实验主要采用Western blotting观察各组肝组织中IRAK-M表达的变化。实验动物同实验一。结果：小剂量LPS处理可明显增强肝组织IRAK-M表达水平,与肝损伤组相比差异有显著性。 综合第一部分的实验结果,归纳如下：①CCl4诱导的慢性肝损伤大鼠模型体内存在肠源性内毒素血症,肠源性内毒素也是造成慢性肝损伤的重要原因。②经多次小剂量LPS处理可以减轻CCl4诱导的慢性肝损伤；③TLR4表达下调是LPS处理减轻慢性肝损伤的机制之一。④LPS处理可能通过上调IRAK-M水平,阻碍了MAPK信号转导通路,从而使致炎因子,尤其是TNF-α产生减少,从而减轻了CCL4诱导的慢性肝损伤。 第二部分多次小剂量LPS处理对非酒精性脂肪性肝炎的影响及其机制研究 实验六多次小剂量LPS处理对高糖高脂诱导的非酒精性脂肪性肝炎的影响 随机将雄性Wistar大鼠分为正常对照组、肝损伤组和LPS处理组。肝损伤组饲以高糖高脂饮食,LPS处理组隔日经皮下注射小剂量LPS,余同肝损伤组。分别在实验第4周末、第9周末,1%戊巴比妥钠麻醉下,无菌无热原条件下取腹主动脉血,离心后检测血浆ET、ALT、TNF-α、IL-10、APN、FPG, FINS水平。取肝左叶10%福尔马林固定,石蜡包埋,5μm切片,做HE染色光镜观察肝组织病理变化,作TUNEL染色观察各组肝细胞凋亡变化。结果：4周肝损伤组内毒素、ALT水平均略高于正常组,差异没有显著性；9周肝损伤组血浆内毒素水平、ALT水平均明显高于正常对照组,提示肝损伤组大鼠体内形成了肠源性内毒素血症,肝组织损伤明显,肝组织切片HE染色也显示,9周肝损伤组肝脏出现以大泡性脂滴为主的脂肪变性,肝小叶和汇管区有大量炎细胞浸润,可见点状和灶状坏死,而9周LPS处理组血浆ALT水平明显降低,脂肪数量少、空泡小,脂肪变性明显减轻；LPS处理组促炎因子TNF-α水平降低,抗炎因子IL-10水平升高,Th1/Th2降低。肝细胞作为LPS的靶细胞,经小剂量LPS处理,凋亡率低于肝损伤组,差异有显著性。 试验七多次小剂量LPS处理对胰岛素抵抗和胰岛β细胞凋亡的影响 该实验通过采用TUNEL法观察胰岛β细胞凋亡的改变。结果,经小剂量LPS处理后,β细胞凋亡明显减少；胰岛素抵抗指数比肝损伤组有所降低,但差异没有显著性,可能与试验时间短有关。 综合第二部分的实验结果,归纳如下：①高糖高脂诱导的非酒精性脂肪性肝炎存在肠源性内毒素血症,肠源性内毒素可能是非酒精性脂肪性肝炎发生发展的重要原因；②多次小剂量LPS处理可以减轻非酒精性脂肪性肝炎；③TH1/TH2下降可能是多次小剂量LPS处理减轻肝损伤的机制之一；④肝细胞凋亡下降与肝损伤减轻相关；⑤多次小剂量LPS处理可使胰岛β细胞凋亡减少、胰岛素抵抗指数下降。 综上所述,得出以下结论： 1、经多次小剂量LPS处理均可减轻CCl4及高糖高脂对大鼠所致的慢性肝损伤。 2、多次小剂量LPS处理减轻CCl4所致的慢性肝损伤与受体和信号转导通路受阻致使致炎因子,主要是TNF-α的减少有关。 3、多次小剂量LPS处理减轻高糖高脂所致的非酒精性脂肪肝炎及其相关的胰岛素抵抗和p细胞凋亡下降与M1/M2(与TH1/TH2相对应)比值下降有关。 4、无论CCl4还是高糖高脂所致的肝损伤均与激活巨噬细胞相关,而多次小剂量LPS处理减轻肝损伤可能都是通过抑制巨噬细胞实现的。