新疆野苹果S基因鉴定与遗传分析研究

新疆野苹果（Malus sieversii）别名塞威士苹果、天山苹果，在我国仅分布于新疆，属于第三纪残遗植物，具有抗寒、耐旱、耐虫和耐病等优良性状，亲和力强，适宜做栽培苹果的砧木，是西北地区及其他产区苹果主要砧木之一，属于配子体型自交不亲和植物。有研究表明在苹果的花柱内含有能够识别自花或者异花花粉的特异性糖蛋白，由自交不亲和性基因（S基因）表达，并具有RNase活性，也称为S-RNase。品种不同，自交亲和性不同，且不同S基因型的品种自交不亲和，但杂交亲和。本研究以99株新疆野苹果为试验材料，鉴定了其S基因型并以此为基础进行遗传规律的探讨，结合田间授粉试验、荧光显微试验以及S-等位基因特异PCR等方法，对新疆野苹果进行分子生物学分析以及杂交亲和性差异的研究，给今后科学保护和利用野生苹果种质资源提供理论依据，也为今后新疆苹果杂交育种和授粉树的选择提供参考。主要研究结果如下： 1.田间授粉试验表明，相同S基因型授粉组合S1S6×S1S6坐果率最低（2.67%），表现出典型的自交不亲和性；部分相同S基因型授粉组合S6S33×S1S6坐果率较高（8.09%），表现出一定的杂交亲和性；不同S基因型授粉组合S21S21×S1S6坐果率最高（21.27%），表现为较强的杂交亲和性。 2.荧光显微试验表明，相同S基因型授粉组合S1S6×S1S6花粉管萌发较晚（授粉后8h）且生长速度较慢，48h后有少量花粉管到达花柱基部，大部分花粉管在花柱1/2-2/3处停止生长，自交不亲和程度较强；部分相同S基因型授粉组合S6S33×S1S6花粉管萌发较晚（授粉后8-10h大量萌发），生长速度适中，48h后80%花粉管到达花柱基部，亲和程度较弱；不同S基因型授粉组合S21S21×S1S6花粉管萌发早（授粉后4-8h大量萌发），96h后全部花粉管到达花柱基部，亲和程度较强。 3.从38对蔷薇科果树常用的引物中筛选出最适引物。结果表明不同的引物组合对参试样本的扩增系数和扩增成功率差异很大，其中引物组合FTQQYQ和anti-1/MIWPNV扩增效果最好。 4.使用最佳引物FTQQYQ和anti-1/MIWPNV对99个新疆野苹果的基因组DNA进行S-基因特异性PCR扩增，共得到了172条清楚完整的条带，克隆测序后，在DNAMAN进行相似性比对，结果表明各个野苹果样本大小相同的条带，它们的序列同源性都在99%以上，因此这些条带属于相同的基因片段，也就是说172条基因片段共包括18个核苷酸序列，大小分别为541bp（S1）、369bp（S6）、348bp（S9）、941bp（S33）、353bp（S48）、368bp（S21）、341bp（S17）、347bp（S40）、473bp（S49）、446bp（S31）、354bp（S35）、308bp（S4）、503bp（S20）、524bp（S24）、668bp（S54）、427bp（S29）、320bp（S7）、1554bp（S39）。 5.根据S-基因的测序鉴定结果和新疆野苹果样本的杂交子代授粉结果，在99个新疆野苹果样本中共得到42种不同的S-基因型：S9S33、S1S6、S6S33、S48S49、S21S49、S21S33、S1S48、S40S33、S49S33、S29S29、S17S31、S6S31、S6S24、S6S49、S49S54、S48S54、S1S9、S9S24、S9S39、S7S39、S7S33、S29S33、S17S49、S31S33、S4S20、S39S40、S1S39、S1S35、S33S39、S6S39、S21S39、S6S21、S1S17S33、S1S6S33、S1S1、S48S48、S21S21、S35S35、S9S9、S49S49、S31S31、S6S6。 6.鉴定了不同S基因型组合的F1代的S基因型，结果表明，无论亲本的S基因型是否相同，其子代的S基因型比例都遵循孟德尔遗传定律。