本研究旨在研究从菊苣根中提取的菊苣多糖对雄性大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用,阐明其对NAFLD的作用机制,研究包括以下四个方面的内容:1菊苣根中菊苣多糖的提取、分离纯化及性质分析采用超声波协同纤维素酶法优化菊苣多糖(chicory polysaccharide,CP)提取的工艺条件,对菊苣粗多糖进行纯化,并研究纯化菊苣多糖的性质。采用响应面分析法中的中心组合设计方法(central composite design,CCD),建立以超声温度、超声时间、加酶量、酶解时间和液料比对菊苣多糖得率的影响的二次回归模型;采用四种方法对提取的粗多糖进行脱蛋白研究;对脱蛋白后的的粗多糖采用DEAE-52纤维素离子交换和Sephadex G-200凝胶层析联合进行纯化;采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)对纯化多糖进行均匀性和分子量检测;紫外扫描、蛋白质含量检测;GC-MS对纯化多糖进行单糖组分分析;利用红外光谱对多糖结构进行鉴定。本研究建立的菊苣多糖提取的最佳工艺条件为超声温度45℃、超声时间35 min、加酶量1.6%、酶解时间1.8 h、液料比44:1(mL/g),在此条件下,菊苣多糖的得率为46.75%,与预测得率47.71%接近;经研究发现酶法-Sevag法联合除蛋白效果最好,蛋白脱除率达90.1%;经离子交换层析获得两个多糖片段,命名为CP-1和CP-2;CP-1的相对分子量为8511.4Da;不含蛋白质;主要由山梨醇、葡萄糖、果糖和葡萄糖醇组成,摩尔比为1.00:5.58:13.97:10.32;属杂多糖,含有α-糖苷键。该回归模型有极显著性,可以作为菊苣多糖提取工艺的回归分析和参数优化。获得的CP-1多糖为中性杂多糖。2菊苣多糖对高脂饲料诱导的大鼠非酒精性脂肪肝的缓减作用研究菊苣多糖CP-1对高脂饲料(high fat diet,HFD)诱导的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠的缓减作用。60 只造模成功的 NAFLD大鼠被随机分成5组,并按以下方法处理:1)模型组(高脂饲料+纯净水),2)低剂量组(高脂饲料+50 mg/kg CP-1),3)中剂量组(高脂饲料+100 mg/kg CP-1),4)高剂量组(高脂饲料+200 mg/kg CP-1),5)药物组(高脂饲料+50 mg/kg洛伐他汀),另设空白对照组(普通饲料+纯净水)。8周后,处死所有大鼠,采集血液,分离血清,测定血清中总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD),葡萄糖(GLU),丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),总胆汁酸(TBA)碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平。取肝脏,称重测定肝脏脏器系数,并测定肝脏中MDA、SOD、TC、TG以及总抗氧化能力(T-AOC)的水平。同时,观察肝脏的组织病理学及超微结构变化。菊苣多糖CP-1能够明显的降低NAFLD大鼠的体重及肝脏指数。显著提高NAFLD大鼠血清中SOD和HDL-C的水平,同时显著降低血清中TC、TG、LDL-C、MDA、GLU、TBA、ALT、AST、ALP 和 LDH 的水平。此外,CP-1 也能有效的降低肝脏中MDA、TC和TG的水平,增加SOD和T-AOC的水平。肝脏组织病理学检查显示CP-1能够明显改善NAFLD大鼠的病理损伤。CP-1对高脂饲料诱导的大鼠NAFLD有明显的缓减作用。3菊苣多糖通过激活AMPK信号通路缓减高脂饲料诱导的大鼠非酒精性脂肪肝研究菊苣多糖CP-1缓减高脂饲料诱导的大鼠非酒精性脂肪肝的机制。以RT-qPCR检测肝脏内脂代谢相关基因:过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CPT-1)、脂肪酸合成酶(FAS)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD-1)的mRNA表达水平。以Western blotting检测肝脏内脂代谢相关蛋白:腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、磷酸化水平及脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、FAS、CPT-1和SCD-1的蛋白表达水平。菊苣多糖CP-1能够显著的上调NAFLD大鼠肝脏PPARα和CPT-1基因mRNA表达,下调SREBP-1c、FAS和SCD-1基因mRNA表达。CP-1还能够上调NAFLD大鼠肝脏中p-AMPK、p-ACC的磷酸化水平及ATGL和CPT-1蛋白的表达,下调ACC、FAS和SCD-1蛋白的表达。CP-1通过激活AMPK相关信号通路对HFD诱导的大鼠NAFLD有明显的缓减作用。4菊苣多糖缓减高脂饲料诱导的NAFLD大鼠的代谢组学研究研究菊苣多糖CP-1缓减高脂饲料诱导的NAFLD大鼠的代谢组学研究。运用超高效液相色谱——四极杆飞行时间质谱联用技术(UHPLC-QTOFMS)检测不同组大鼠肝脏代谢标志物。采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)筛选不同组大鼠间的差异代谢标志物。利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)进行差异代谢物的KEGG注释。采用MetaboAnalyst进一步对差异代谢物的代谢通路进行分析。PCA结果表明,除了低剂量组与模型组代谢谱离散度无明显差异,空白组、药物组、中剂量组以及高剂量组与模型组相比,代谢谱离散度有明显差异。OPLS-DA结果表明,空白组与模型组以及高剂量组与模型组组间差异显著;空白组和模型组经筛选获得487个代谢标志物,其中223个代谢标志物上调,264个代谢标志物下调;高剂量组和模型组经筛选获得373个代谢标志物,其中157个代谢标志物上调,216个代谢标志物下调。途径分析表明,空白组和模型组差异代谢物参与了 16条代谢通路,高剂量组与模型组差异代谢物参与了 13条代谢通路。进一步研究表明,空白组和模型组差异代谢物参与的关键代谢通路为7条,高剂量组与模型组差异代谢物参与的关键代谢通路也为7条。我们的发现不仅为深入了解NAFLD的发病机制提供了系统的理论依据,而且为CP-1防治NAFLD提供了理论依据。综上总述,菊苣多糖CP-1能够缓减由高脂饲料诱导的大鼠非酒精性脂肪肝,为CP-1防治NAFLD提供了理论依据。
