一、目的
探索慢性不可预知温和应激(CUMS)和利血平拮抗两种抑郁症大鼠模型肝郁脾虚证的证候时间窗；通过对证方剂反证两种抑郁症大鼠模型肝郁脾虚证证候时间窗的可靠性。探索抑郁症大鼠肝郁脾虚证的下游即蛋白水平和上游即基因水平的生物学机制。
二、方法
(一)采用CUMS和腹腔注射利血平两种方法建立大鼠抑郁症模型,通过体重测定、糖水消耗实验、行为学测定、临床症状等效转化为大鼠宏观表征等方法来进行大鼠的证候判别。Elisa法测定血清中5-羟色胺(5-HT)含量,免疫组织化学法测定脑组织海马CA2区5-HT含量；
(二)根据实验一得出的各时间点肝郁脾虚证大鼠所占比例调整各组大鼠的分配数量,仍采用CUMS和腹腔注射利血平两种方法建立大鼠抑郁症模型,证候判别方法同实验一,根据实验一得出的两种模型的证候时间窗,利血平组肝郁脾虚证大鼠在注射药物4周后予逍遥散灌胃,CUMS组肝郁脾虚证大鼠在应激6周后予逍遥散灌胃,对于服用逍遥散后证候发生变化的大鼠停止使用逍遥散,但是指标检测和数据统计时仍将其计入。通过体重、糖水消耗实验、行为学测定、宏观表征量表积分等指标的测定评估逍遥散对肝郁脾虚证大鼠的影响；
(三) Elisa法检测血清血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)、去甲肾上腺素(NE)、同型半胱胺酸(HCY)、5-羟色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、环磷酸腺苷(cAMP)、多巴胺(DA)、β-内啡肽、超氧化物歧化酶(SOD)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。高效液相色谱法检测脑组织中NE、DOPAC、 DA、5-HIAA、HVA和5-HT含量。免疫组化法检测肾上腺组织中CORT表达量；
(四)对抑郁症肝郁脾虚证大鼠脑组织和肝组织进行数字化基因表达谱分析。第一步进行样本质量检测,第二步制备DGE文库,第三步上机测序,第四步进行生物信息分析。
三、结果
(一)综合各时间点各组大鼠体重值、糖水偏嗜程度、行为学指标、宏观表征舌色RGB值得出：CUMS组和利血平组大鼠在干预2周后均出现了抑郁状态；CUMS组大鼠应激6周后出现肝郁脾虚证,利血平组大鼠注射药物4周后出现肝郁脾虚证。与正常组相比,CUMS组和利血平组大鼠干预8周后脑组织5-HT含量降低(P<0.05),血清和小肠组织5-HT含量持续升高(P<0.05)且升高的程度两组大鼠在不同时期存在差异。
(二)各组抑郁症肝郁脾虚证大鼠在逍遥散灌胃后,体重值、糖水偏嗜程度、旷场实验穿格次数和活动总距离、强迫游泳试验中出现不动状态时间均与实验一同期相比有不同程度的改善,大鼠舌体R值两实验相比无明显差异。同时,在本实验中我们还对各组大鼠在逍遥散服用前及服用后各时间点进行了宏观表征采集量表积分,发现在大鼠服用逍遥散后宏观表征采集量表积分逐渐升高,逍遥散对抑郁症肝郁脾虚证的证候疗效是有效的。
(三)应激性抑郁症和利血平拮抗型抑郁症肝郁脾虚证发生时,血清中含量上升的指标有：Ang II.HCY.5-HT、CRH.ACTH;血清中含量下降的指标有：GABA、cAMP、DA、β-内啡肽、SOD、T、E2:血清中含量不变的指标有TNF-α；脑组织中NE、DOPAC.DA.5-HIAA、HVA和5-HT含量均下降；肾上腺组织中CORT表达量上升。应激性抑郁症肝郁脾虚证发生时,血清NE含量先上升后下降；利血平拮抗型抑郁症肝郁脾虚证发生时,血清NE含量持续下降。
(四)CUMS组肝郁脾虚证大鼠脑组织与正常组大鼠相比有190个基因上调,684个基因下调；利血平组肝郁脾虚证大鼠脑组织与正常组大鼠相比有155个基因上调,476个基因下调。CUMS组肝郁脾虚证大鼠肝组织与正常组大鼠相比有18个基因上调,508个基因下调；利血平组肝郁脾虚证大鼠肝组织与正常组大鼠相比有88个基因上调,420个基因下调。差异表达的基因作用的靶点主要集中在5-羟色胺突触、GABA突触、多巴胺突触、钙信号转导通路、神经营养因子信号通路、促性腺激素释放激素信号转导通路、NO和谷氨酸盐信号通路、抗原加工和呈递过程、吞噬作用、肠道免疫网络中。
四、结论
(一)抑郁症肝郁脾虚证病证结合大鼠模型的证候时间窗
应激性抑郁症大鼠肝郁脾虚证的证候时间窗为应激后6-8周；利血平拮抗型抑郁症大鼠肝郁脾虚证的证候时间窗为注射药物后4-8周。经对证方剂反证后确认该时间窗是可靠的。
(二)抑郁症肝郁脾虚证病证结合大鼠模型的下游生物学机制
1. CRH-ACTH-CORT通路被激活后呈正反馈调节参与了应激性抑郁症肝郁脾虚证的形成过程；
2.血清中AngⅡ、HCY、5-HT的升高和GABA、cAMP、DA、SOD、T、E2的下降以及脑组织中NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA和5-HT含量的下降是应激性抑郁症和利血平拮抗型抑郁症肝郁脾证形成的共同机制。
(三)抑郁症肝郁脾虚证病证结合大鼠模型的上游生物学机制
1.两种抑郁症肝郁脾虚证模型均与5-羟色胺突触、GABA突触、多巴胺突触的功能异常有关。其中PKC基因和PKA基因是一对表达效应相反的关键基因,Gi/o基因群在抑郁症肝郁脾虚证中发挥着重要的作用。结合抑郁症肝郁脾虚证的下游生物学机制,推测中枢5-HT与外周5-HT可能是两个独立的系统,中枢PKA与外周cAMP可能存在共同通路并且共同参与了抑郁症肝郁脾虚证的发生和发展过程；
2.两种抑郁症肝郁脾虚证模型均与钙信号转导通路的异常有密切关系；
3.两种抑郁症肝郁脾虚证模型均与免疫有关,主要表现为主要组织相容性复合基因I型(MHCI)和主要组织相容性复合基因II型(MHCH)表达下调。结合抑郁症肝郁脾虚证的下游生物学机制,推测炎性因子TNF-α可能没有参与抑郁症肝郁脾虚证与免疫相关的病理生理过程。
