单细胞水平人参皂苷Rg2抗化疗致骨髓抑制效应及作用机制研究

化疗是恶性肿瘤临床治疗的常规手段之一,在治疗的过程中往往带来各种毒副作用,其中以骨髓抑制最为严重,这直接影响患者的疗效、预后及转归。防治骨髓抑制是恶性肿瘤化疗成功的关键,而补血益气类中药在临床上已彰显疗效。在“补血养气类中药治疗化疗引起骨髓抑制”这一重要的中医实践中,阐明其药物活性成分以及作用机制是其关键科学问题之一。在前期的工作研究中,我们对一个以两仪膏为基方的补血益气类组方的抗骨髓抑制活性物质进行了初步筛选,发现了包括人参皂苷Rg2在内的多种活性成分。骨髓微环境成分复杂,研究药物对机体造血功能的作用时需对其进行全面评价;此外,造血细胞存在显著异质性,在单细胞水平对骨髓造血微环境进行功能辨识已是骨髓造血功能研究的必需手段。本论文在前期研究结果基础上,选取人参皂苷Rg2,以骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）和骨髓造血细胞这两种骨髓微环境的主要构成细胞成分为研究对象,从以下三方面展开其对化疗致骨髓抑制小鼠的促造血效应及作用机制研究:1.通过一次性腹腔注射200 mg/kg 5-氟尿嘧啶（5-FU）建立骨髓抑制小鼠模型,同时灌胃给予20 mg/kg人参皂苷Rg2,分别在造模的第5、10、14天动态检测股骨组织病理学、骨髓有核细胞数变化,并采用流式细胞术和集落生成实验分别测定造血干细胞（Lin-Sca1+Kit+,LSK）以及粒/单核系、红系、pre-B造血祖细胞集落数目以评价造血干/祖细胞造血功能。结果显示:在第5天,人参皂苷Rg2未显示明显药效;在第10和14天,人参皂苷Rg2具有促进5-FU致骨髓抑制小鼠造血功能恢复的效应,用药后骨髓组织形态得以改善,骨髓有核细胞、粒/单核系和pre-B造血祖细胞的数目均显著提高。2.基于骨髓抑制小鼠模型,分别在造模给药后第5、10天,分离骨髓细胞进行骨髓细胞长期培养,同时提取BMSCs进行RNA-seq和生物信息学分析。结果显示:人参皂苷Rg2具有促进受损基质细胞增殖、分化效应;IL-6是其作用分子网络中的关键效应分子,在连续给药后的第10天,人参皂苷Rg2可显著回调5-FU改变的IL-6表达,提示其对骨髓抑制所诱发的IL-6炎症损伤具有保护效应。3.造模后第10天,提取骨髓细胞,应用10x Genomics ChromiumTM系统和Illumina平台进行单细胞分离、标记和单细胞转录组测序（single-cell RNA-seq,sc RNA-seq）,以生物信息学分析手段评价人参皂苷Rg2对各系造血细胞的作用并确定其作用靶细胞。首先采用降维、聚类和标记基因（marker）注释还原骨髓造血细胞各异质群,将造血细胞分为造血前体细胞、髓系细胞、淋巴系细胞等主要群体。结果显示:5-FU造模后第10天,造血终末细胞存在“不平衡恢复”现象,表现为髓系（粒系、单核/巨噬细胞）、B系细胞数目大量减少,T细胞、NK细胞、树突状细胞、浆细胞数目大量增加;而人参皂苷Rg2用药后,各细胞群数目接近正常水平,提示其可以纠正5-FU引起的各系造血细胞在数目上的不平衡恢复。随后采用伪时序分析追溯药物起效的靶细胞,结果表明其为造血前体细胞。基于组间（5-FU vs Ctrl、5-FU+Rg2 vs 5-FU）差异分析,采用差异基因筛选和生物学过程评分从基因表达和功能表达两方面对造血前体细胞进行整体研究,结果显示:1)基因表达差异:5-FU上调了Cd74、Igkc、Ccl5等与树突状细胞、浆细胞、NK细胞等相关的谱系特异性基因表达,下调了Camp、S100a8、S100a9等与粒系相关的谱系特异性基因表达;而人参皂苷Rg2对上述基因有回调效应。2)功能表达差异:人参皂苷Rg2提高了造血前体细胞的髓系分化能力、降低其树突状和淋巴系分化能力。结果表明其可作用于造血前体细胞,通过稳定分化相关谱系基因的表达,从而纠正5-FU损伤后代偿性造血所存在的髓系分化减少、树突状和淋巴系分化增加等“不平衡恢复”现象。最后通过对造血前体细胞的重新降维、聚类及注释分析揭示了稳态、5-FU损伤下和人参皂苷Rg2用药治疗后骨髓中存在不同功能的造血前体亚群,确定人参皂苷Rg2作用靶细胞为一群以Lin-Sca1+Kit+Flt3-Cd150+Cd48+Vwf+为标志的多能造血祖细胞（MPPs）。综上所述,本论文全面评价了人参皂苷Rg2促化疗致骨髓抑制小鼠造血效应,并首次通过sc RNA-seq技术发现了Lin-Sca1+Kit+Flt3-Cd150+Cd48+Vwf+MPPs为人参皂苷Rg2的作用靶细胞,人参皂苷Rg2通过调控相关谱系基因表达,促进化疗损伤后骨髓造血功能恢复并维持造血微环境稳态。