补肾壮骨类中药多糖的抗骨质疏松作用及促进骨形成机制的初步探讨

中医认为骨质疏松症属于“骨痹、骨萎”范畴,病因病机以肾虚为主,临床多以“肾藏精,主骨生髓”“肾主骨”为理论依据,选用补肾壮骨类中草药进行治疗。本课题组前期选取四种临床常用的补肾壮骨类中草药怀牛膝(AB)、仙茅(CO)、金毛狗脊(CB)和啤酒花(HL),研究发现多糖为其治疗骨质疏松的有效部位。本论文研究CO四个多糖部位对去势模型大鼠骨质疏松症的治疗作用;取模型大鼠的血清用于代谢组分析以寻找骨质疏松的生物标志物,并评价AB四个多糖部位的抗骨质疏松作用;检测CB和HL中五个精多糖对小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1体外增殖、分化和矿化的影响,并从基因水平和蛋白水平初步探讨活性多糖促进骨形成的作用机制。将仙茅(CO)多糖CO50、CO70、CO90和COB作用于去势模型大鼠,研究其对大鼠骨质疏松症的影响。将大鼠左侧胫骨切片并进行甲苯胺蓝染色,分析其骨组织形态计量学指标,以骨小梁和皮质骨的变化评价仙茅多糖的抗骨质疏松作用。结果表明CO50、CO70和COB均不同程度的改善大鼠骨质疏松症,显著提高模型大鼠骨小梁数量、厚度,皮质骨面积百分数、平均皮质骨厚度,骨外膜、骨内膜标记周长百分数,提高骨外膜、骨内膜矿化沉积率和骨形成率,降低骨小梁分离度,说明CO50、CO70和COB具有显著的抗骨质疏松作用,其中CO70组效果最佳。金毛狗脊(CB)和啤酒花(HL)的多糖部位经分离纯化后得精多糖CBB-1、CBB-2、CBB-3、HL70-2和HL90-1。将五种精多糖分别作用于小鼠成骨样细胞MC3T3-E1,利用CCK-8检测多糖对成骨细胞增殖的影响,ALP活性检测多糖对成骨细胞分化能力的影响,茜素红和十六烷基吡啶分别定性和定量检测多糖对成骨细胞矿化的影响,荧光定量PCR检测成骨相关基因的变化。结果表明多糖CBB-1、HL70-2、HL90-1可促进MC3T3-E1细胞的增殖;CBB-1、HL90-1及CBB-2可提高细胞的ALP活性;CBB-1、HL90-1可显著提高细胞的矿化率。即精多糖CBB-1和HL90-1显著促进成骨细胞分化、矿化。且CBB-1显著上调MC3T3-E1细胞分化早期关键基因Ost、Runx2以及中后期关键基因Bsp和Ocn的表达水平,HL90-1能够显著上调细胞分化早期基因Runx2、Bsp和早期蛋白BMP2及Runx2的表达量,从而促进MC3T3-E1细胞的分化和矿化。取去势模型大鼠的血清用于代谢组分析以寻找骨质疏松的生物标志物,并评价AB多糖的抗骨质疏松作用。模型组血清中戊二酰肉碱,lysoPC(18:1)和9-顺式-视黄酸的含量与假手术组相比有显著性差异,推测其为骨质疏松症的生物标志物,模型组和假手术组间有显著性含量差异的27个化合物中15个与脂代谢有关,说明骨质疏松的发生与脂代谢紊乱密切相关。代谢组学分析表明多糖AB50、AB90具有显著的抗骨质疏松作用,且AB50效果更好,与体内实验结果吻合。