miR-5100和中药方剂对成骨分化的作用机制研究

骨质疏松的特征主要是骨量减少和骨结构塌陷,导致骨脆性增加,增大了骨折的风险。由此,它是威胁人类健康、影响生活质量的一类常见疾病。正常骨量的维持依赖于成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收之间的动态平衡。因此研究骨形成的各种调控机制是非常有意义的。MiRNA是一种非编码的单链RNA,长度大约为18-25个核苷酸。它可以结合到靶基因mRNA的3’UTR上,引起mRNA降解或者抑制其翻译,实现转录后水平的调控。研究表明,多种miRNA可以通过不同机制调节成骨分化,在骨形成和骨质疏松的病理生理学方面起着非常重要的作用。而我们知道,一种miRNA可以调控多种靶基因。同样,一种靶基因可受到多种不同miRNA的调控。MiRNA和靶基因间复杂的调控网络构成了多种生命过程的调节机制。我们希望找到更多种新型的miRNA,来完善这一调控网络,进一步阐明成骨分化的调控机制,以探寻一种新型的预防及治疗骨质疏松的途径。依据“肾藏精主骨生髓”的中医理念,近年来,一些温补肾阳气血的中药方剂被逐渐运用于临床当中,并收到了很好的效果。如肾气丸、十全大补汤等在临床上均可用于预防及治疗骨质疏松。但其分子机制尚未阐明。目的：本研究旨在探讨miR-5100对成骨分化及矿化的影响,探索一种miRNA与靶基因调控的新途径。同时探讨肾气丸和十全大补汤在成骨分化中的作用,为指导临床用药提供理论支持。方法：我们用抗坏血酸和Na3PO4来诱导细胞,构建成骨细胞矿化模型。我们利用qRT-PCR来检测miR-5100在成骨分化中的表达情况。转染mimic和inhibitor后观测过表达及抑制表达miR-5100后对矿化的影响。随后,用TargtScan软件预测了miR-5100的靶基因,并用双荧光素酶载体和Western blot对其进行了验证。探索了一种miRNA调控新模式。同时,我们分析不同种温补肾阳气血的中药方剂水煎液对成骨细胞分化及矿化的影响。ALP活性检测用于测定处理前后ALP活性变化。利用茜素红染色可以将钙结节染成桔红色的原理,来直观的判定矿化程度,以研究药物对矿化的作用。同时,我们利用qRT-PCR来检测成骨标志基因ALP, RUNX2及OCN的表达情况。结果：1.构建了成骨矿化细胞模型ST2和MC3T3-El。2.miR-5100在成骨分化过程中表达上调。3.上调miR-5100后促进ALP活性及成骨标志基因的表达,促进矿化结节的产生。下调后抑制ALP活性及成骨标志基因的表达,抑制矿化结节的产生。4.预测及验证了miR-5100的靶基因Tob2,证实miR-5100通过靶向调控Tob2,而影响OSX的表达,进而影响成骨分化及矿化。5.肾气丸和十全大补汤均可促进ALP活性及成骨标志基因的表达。促进矿化结节的产生。结论：我们发现了一种可以促进成骨分化及矿化的新型的miRNA,并研究了它的调控机制,完善了骨形成中miRNA和靶基因间的调控网络。提示了一种新型的预防及治疗骨质疏松的途径。同时,我们证实了肾气丸和十全大补汤均可以促进成骨分化及矿化,为指导临床用药提供了理论支持。