油茶泛素结合酶E2基因全长cDNA克隆及其RNAi干扰载体的构建

油茶(Camellia oleifera)是一种多年生木本科油料作物,是我国重要的木本食用油料树种。茶油主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸组成,其含量一般在90%以上,是当前国内最受欢迎的高营养价值的食用油之一。由于油茶种子的发育过程处于南方高温、干旱天气,土壤贫瘠等生理环境,因此油茶在生长发育过程中,会遭受到一些非生物胁迫,如干旱、重金属、营养缺乏、高盐,病虫害、高温或低温等。介导蛋白质特异降解的泛素/26S蛋白酶体途径显著影响着植物的生长发育,泛素结合酶E2作为该途径中的一个关键酶,对植物的细胞周期调控、植物衰老、细胞分化、激素信号响应、光形态建成及非生物胁迫响应等产生了重要的影响。本研究在已有的油茶种子cDNA文库及EST文库的基础上,对油茶E2基因进行全长cDNA的克隆和生物信息学分析,并构建了植物RNAi干扰载体。主要研究结果如下： 1、油茶E2基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析。从本实验室油茶cDNA文库中鉴定出一条E2基因的全长cDNA,该基因长度为804bp,经与核酸数据库进行比对分析,确定为E2基因,该基因编码152个氨基酸。应用一系列生物信息学分析方法对其等电点、分子量、跨膜结构、疏水性、二级结构等进行预测分析,结果显示：E2蛋白质的分子量为17.4KDa,等电点为5.40。E2整个蛋白的疏水指数从-3.633到2.122,其中除在37位、102位以及105位氨基酸表现出疏水性,整条多肽链表现出亲水性。E2蛋白有两个不明显的跨膜区。二级结构预测发现油茶E2蛋白二级结构以α螺旋结构为主,不规则卷曲散布于整个蛋白质中。油茶E2蛋白第77～92位为泛素结合酶活性位点,其中活性位点中的半胱氨酸位于第88位。 2、油茶E2基因的RNAi干扰载体构建。采用片段替换方法构建了中间载体pMD19-Dimer。根据油茶E2基因的序列特点,设计引物克隆了RNAi干扰载体片段。将干扰片段依次插入到中间载体pMD19-Dimer上。检测RNAi中间载体构建成功后,用引物XbaⅠ和SacⅠ分别双酶切pMD 19-Dimer-E2-RNAi和植物载体pBI121,回收连接,构建植物干扰载体pBI-E2-RNAi。