Sul-F对心肌损伤的保护作用及其机制研究

芒柄花素（formononetin,7-羟基-4'-甲氧基异黄酮）为水溶性差、口服吸收差的异黄酮化合物,广泛分布于甘草、葛根、红车轴草等豆科植物中,具有解痉、降血脂、抗心律不齐、改善雌激素水平等作用;我们的体外研究发现其具有显著的心肌保护作用;芒柄花素磺酸钠（sodium formononetin-3'-sulfonate,Sul-F）是芒柄花素的磺化产物,在不影响药理作用的前提下大幅度提高了水溶性,为了快速起效,制成了无菌注射液;我们通过不同动物（大鼠、犬）、不同缺血模型（冠脉结扎致心肌缺血和缺血再灌注模型）、不同给药方法（单次静注、亚慢性连续静注）,考察了Sul-F的心肌保护作用,并通过体内外心肌损伤模型,研究了Sul-F抗心肌缺血作用机制。 第一部分,Sul-F对心肌缺血损伤的保护作用 1.Sul-F对冠脉结扎致大鼠致急性心肌梗死的保护作用 结扎大鼠左侧冠脉制作急性心肌梗死模型,结扎5 min时尾静脉注射给予2.5～160 mg/kg的Sul-F,观察给药后4 h之内的心电图变化,给药6 h取心脏,TTC染色,比重法计算左心室心肌梗死百分比,ED50约为18.85 mg/kg。尾静脉注射给予10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg的Sul-F,能降低冠脉结扎大鼠30～240 min心电图J点的抬高,抑制血清酶LDH、AST和CK活性的升高,缩小心肌梗死范围。静脉给予20mg/kg的Sul-F可显著降低心肌梗死面积,而灌胃给予200和600mg/kg剂量的Sul-F无效。 2. Sul-F对冠脉结扎致大鼠心肌梗死的长期保护作用 结扎大鼠左侧冠脉制作急性心肌梗死模型,24 h后静脉给予20 mg/kg的Sul-F,每天给药1次,连续14天,Millar导管经颈总动脉导入左心室测定血流动力学指标,取心脏计算心脏系数。结果显示,Sul-F能显著升高±dp/dtmax、SP、DP和AP,对LVSP、LVEDP和HR未见明显影响。 3. Sul-F对冠脉结扎致犬急性心肌梗死的保护作用 结扎Beagle犬冠状动脉左前降支制作急性心肌梗死模型,结扎10 min时舌下静脉注射给予3 mg/kg、6 mg/kg和12 mg/kg的Sul-F,观察结扎4 h之内的血流动力学指标和EECG变化,并在结扎前、结扎2 h和结扎4 h分别取动脉血测定血氧,血流动力学测定完毕采血测定血清LDH、AST、CK活性,同时测定心肌梗死百分比。结果显示:6～12 mg/kg的Sul-F可抑制冠脉结扎犬的Σ-ST和N-ST升高、降低心肌梗死范围,抑制血清LDH、CK和AST活性升高。6～12 mg/kg的Sul-F在冠脉结扎后不同时间点抑制CO、SV、SW、CI和SI的降低,抑制SP、DP、AP、LVSP、±dp/dtmax的降低;6～12 mg/kg的Sul-F在冠脉结扎不同时间点抑制CBF、MBF和MOCI的降低,抑制MOUR的升高;12 mg/kg的Sul-F抑制TPVR的升高。3～12 mg/kg的Sul-F对冠状动脉结扎犬LVEDP、HR、MVO2无明显影响。 第二部分,Sul-F对心肌缺血再灌注损伤的保护作用 1. Sul-F对缺血再灌注致大鼠急性心肌梗死的保护作用; 制作大鼠心肌缺血再灌注心肌梗死模型,再灌5 min时尾静脉注射给予10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg的Sul-F,观察3 h之内的心电图变化,给药3 h后测定血流动力学,采血测定血清酶活,取心脏计算左心室心肌梗死百分比。结果显示,20～40 mg/kg的Sul-F能够降低缺血再灌注大鼠心电图J点的抬高和心肌梗死范围,升高+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP、DP和AP,显著降低大鼠血清CK、LDH和AST活性。 2. Sul-F对缺血再灌注致大鼠心肌梗死的长期保护作用 制作大鼠心肌缺血再灌注心肌梗死模型,24 h后静注20 mg/kg的Sul-F,每天给药1次,连续14天,Millar导管测定血液动力学指标,取心脏,计算脏器系数,常规病理切片,行HE染色和Masson染色,观察病理组织学变化,计算心肌胶原容积分数（CVF）。结果显示,亚慢性给予Sul-F能抑制+dp/dtmax和-dp/dtmax的降低,可减轻缺血再灌注损伤引起的心肌纤维断裂缺损、心肌细胞坏死伴纤维化和炎性细胞浸润,降低CVF百分率。 第三部分,Sul-F抗心肌缺血和缺血再灌注损伤的作用机制研究 1. Sul-F对H9c2细胞氧化损伤的保护作用及机制研究 H9c2细胞贴壁24 h,加入含不同浓度的Sul-F培养24 h,加入100μM的H2O2,孵育1 h。采用细胞流式细胞仪,Annexin-V和PI双染心肌检测凋亡率,R123染色法检测细胞膜电位,Fluo-3染色法检测细胞内钙;ELISA法检测上清液Bcl-2和Bax表达。结果显示,31.2～62.5 nM的Sul-F可降低H2O2诱导的心肌细胞损伤;25 156 nM的Sul-F均能降低H2O2引起的细胞凋亡发生率,抑制H2O2诱导的细胞膜电位降低;62.5 nM Sul-F能抑制缺氧心肌细胞内Ca2+浓度的升高;62.5～156nM的Sul-F可导致Bcl-2表达量和Bcl-2/Bax比值显著升高。 2. Sul-F对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响 制作大鼠心肌缺血再灌注心肌梗死模型,灌注5 min时尾静脉注射给予20 mg/kg的Sul-F,再灌注185min取心脏,常规病理切片,行TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,免疫组化染色检测Bcl-2、Bax和p-Akt蛋白表达。结果显示:20 mg/kg的Sul-F能够抑制缺血再灌大鼠心肌细胞的凋亡,提高Bcl-2蛋白的表达和Bcl-2/Bax比值,增加p-Akt蛋白表达。 综上所述,Sul-F急性给药和亚慢性给药均可缩小心肌缺血或缺血再灌注损伤的心肌梗死面积,降低血清酶活性,改善血液动力学,增强心脏功能,减轻心肌病理改变;降低氧化损伤引起的细胞钙超载、抑制线粒体膜电位改变。其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号转导通路,上调Bcl-2/Bax比值,抑制线粒体凋亡途径细胞凋亡有关。