肝移植急性排斥大鼠肠道微生态变化特征及肠道菌群改变对排斥大鼠肝损伤的影响研究

肝移植是目前治疗各种终末期肝病如急性或慢性肝功能衰竭、肝硬化、肝脏恶性肿瘤及一些罕见肝脏代谢性疾病的有效手段。然而,肝移植后排斥和感染始终是影响肝移植成功与否的重要因素,也是导致患者术后死亡的主要原因。细菌易位是手术及危重病人发生感染的重要病理生理机制。以前的研究表明,肝移植大鼠在应用免疫抑制剂情况下肠道菌群会发生改变。研究报道,移植后细菌易位与免疫排斥相关。肝移植术后排斥反应是否导致肠道菌群的变化?如何变化?此变化与细菌易位的关系如何?目前肝移植术后肠道微生态相关研究相对较少。我们推测肠道菌群改变亦能改变肝损伤进程,并在这一病理过程中发挥着重要的作用。肠道菌群结构(抗生素和益生菌作用)改变后,对异基因肝移植大鼠肝脏功能是否有重要影响?如果有,可能机制是什么?这些都是我们一直所关心的问题,但目前为止尚无相关报道。为此,本课题利用本实验室微生态学及免疫学平台,开展了以下两部分工作：一、观察原位肝移植术后肠道菌群结构的动态变化,揭示肝移植排斥反应情况下肠道菌群结构变化特征及其与细菌易位的关系。二、分析应用抗生素和益生菌改变肠道菌群结构变后,对异基因肝移植大鼠肝脏炎症水平的影响及相应机体和肠道局部免疫变化,初步揭示肠道菌群在移植后肝脏炎症发生发展中的作用。 本研究第一部分运用PCR-DGGE、454测序及荧光定量PCR方法动态监测大鼠(假手术组,同基因肝移植组,异基因肝移植组)原位肝移植手术前后粪便菌群结构变化,同时检测内毒素水平及细菌易位率。DGGE指纹图谱分析表明术前1天三组大鼠的粪便菌群结构相似。术后1周和2周,同基因肝移植组大鼠粪便菌群结构与假手术组大鼠相似,异基因肝移植组大鼠在术后与其他两组相比有显著差异。采用454测序进一步明确肠道菌群变化特征,主成份分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示在门的水平,肝移植术前1天各组间粪便菌群没有明显差别,肝移植术后1周各组间有分开的趋势,而肝移植术后2周异基因肝移植组与其他两组明显区分开来。肝移植术后1周异基因肝移植组粪便厚壁菌门比例下降。肝移植术后2周异基因肝移植组粪便厚壁菌门比例下降,而拟杆菌门和蛋白菌门比例上升。在科的水平,肝移植术后2周异基因肝移植组粪便瘤胃球菌科和毛螺菌科减少,而潜在致病菌如肠杆菌科和拟杆菌科增加,定量PCR也证实,异基因肝移植组大鼠粪便拟杆菌及肠杆菌在术后2周显著增加。肝移植术后2周异基因肝移植组内毒素水平及细菌易位率亦显著增加。 第二部分采用抗生素(庆大霉素)和益生菌(培菲康)灌胃改变肠道菌群结构。DGGE指纹图谱分析显示灌胃1周后,抗生素组大鼠粪便菌群多样性即明显减少,与异基因肝移植组和益生菌组的菌群结构有很大的差异。抗生素和益生菌对肠道菌群结构的影响与肠道部位相关,可显著改变回肠和结肠黏膜菌群多样性而对空肠黏膜菌群无明显影响。肝移植术后2周,抗生素组和益生菌组大鼠肝功能损伤较异基因肝移植组明显减轻。抗生素和益生菌组大鼠肠道PP淋巴结CD4/CD8比值较异基因肝移植组降低,益生菌组大鼠肠道淋巴结Treg细胞比例明显高于异基因肝移植组。外周血CD4/CD8比值及Treg细胞比例三组间无明显区别。益生菌组大鼠外周血血清中IL-2水平均明显降低,抗生素组大鼠肠道菌群紊乱发生后血清中各因子水平有所降低,但无统计学意义。 结合上述两部分研究中肝移植急性排斥大鼠模型中肠道菌群的变化特点,以及肠道菌群改变状态下异基因肝移植大鼠机体及肠道炎症与肝脏损伤关系,我们得出以下几点结论： (1)肝移植急性排斥反应可造成大鼠肠道菌群结构显著失衡,瘤胃球菌科和毛螺菌科减少,而潜在致病菌如肠杆菌科、拟杆菌科增加,进而导致细菌易位及内毒素水平增加,提示毛螺菌科及瘤胃球菌科细菌可作为潜在益生菌开发,用于防治肝移植术后感染发生。 (2)应用抗生素(庆大霉素)显著减少大鼠粪便菌群结构多样性,且对肠黏膜菌群结构的影响与肠道部位相关,可显著改变回肠和结肠黏膜菌群多样性而对空肠黏膜菌群无明显影响。 (3)益生菌可显著降低异基因移植大鼠肠道淋巴结CD4/CD8比值,增加肠道淋巴结Treg细胞比例,降低血清中IL-2水平,从而减轻异基因肝移植大鼠术后肝损伤。