慢性应激肝郁脾虚模型大鼠下丘脑弓状核摄食相关神经肽变化机制研究

目的:在前期实验研究基础上,本课题通过慢性束缚应激方法来建立肝郁脾虚证候动物模型,以免疫荧光双染、激光共聚焦成像、实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)等技术与方法,从基因与蛋白水平,分析下丘脑弓状核(Arcuate nucleus,ARC)中具有抑制摄食作用的瘦素受体(ob-R)、可卡因-安非它明调节转录因子(Cocaine amph-etamine-regulated transcript,CART)、前阿黑皮(Proopiomelanocortin,POMC)、α-促黑素细胞激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)的表达,为肝郁脾虚证候机体所表现的食欲下降、体重减轻、便溏等脾胃运化功能失常的生物学基础提供实验依据;同时以中药复方逍遥散(《太平惠民和剂局方》)作为干预用药,揭示其疏肝解郁、健脾以调节食欲的作用靶点与机理。方法:SD大鼠随机分为4组,即正常对照组(简称正常组)、7天模型组、21天模型组、逍遥散组。正常组大鼠不施加应激措施,正常饲养;7天模型组、21天模型组大鼠分别予每天连续3h、连续7天、21天的慢性束缚应激方法(将大鼠束缚固定于特制的T型台)建立动物模型;逍遥散组大鼠慢性束缚应激21天同时予灌服中药复方逍遥散。7天模型组于实验第8天取材;正常组、21天模型组与逍遥散组于实验第22天取材。动态观测4组大鼠体重、摄食量、饮水量、外观表征和行为学变化(旷场试验、高架十字试验)。以免疫荧光双染、激光共聚焦成像、RT-q PCR等技术与方法,观测大鼠下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH基因和蛋白表达。结果:1大鼠一般外观表征与行为学的变化与正常组大鼠比较,模型组大鼠体重、摄食量、饮水量呈缓慢增长的趋势;一般外观表现出现嗜睡懒动、反应迟钝、皮毛枯黄晦暗、耳廓爪部色泽变淡、大便干湿不调等变化;在束缚造模第0天,旷场试验各组大鼠5min内总穿格数、中央区停留时间、站立次数、修饰次数基本处于同一水平,随着实验进程,模型组大鼠的中央区停留时间明显增加,总穿格数、站立次数、修饰次数呈现减少的趋势。高架十字试验各组大鼠进入开放臂次数、开放臂停留时间、进入封闭臂次数、封闭臂停留时间基本无差别,随着实验进程,模型组大鼠进入开放臂次数和开放臂停留时间呈下降趋势,进入封闭臂次数及封闭臂停留时间呈现增加的趋势,而逍遥散组大鼠体重、摄食量、饮水量、行为学各项指标的改善比较明显,一般外观表征也有显著改善作用。2免疫荧光双染观测各组大鼠下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白表达变化在整个实验过程中,随着束缚的持续施加,21天模型组大鼠下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH的表达阳性面积、平均光密度、积分光密度、阳性细胞数均较正常组增加,CART、POMC、a-MSH与ob-R共染面积的表达亦较正常组增加;灌服3周逍遥散后,各项指标均有下降趋势,尤以ob-R与CART明显。3 RT-q PCR观测各组大鼠下丘脑ARC中ob-R m RNA、CART m RNA、POMC m RNA、α-MSH m RNA表达变化在整个实验过程中,随着束缚的持续施加,21天模型组大鼠下丘脑ARC中ob-R m RNA的表达较正常组明显增加(P<0.01),但CART m RNA、POMC m RNA、α-MSH m RNA的表达较正常组增加,无统计学意义(P>0.05)。逍遥散可以下调大鼠下丘脑ARC中ob-R m RNA、CART m RNA、POMC m RNA、α-MSH m RNA的表达。结论:1 21天模型组大鼠下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白与基因处于高表达水平,尤以ob-R明显,表明ob-R的蛋白与基因表达下降,是慢性应激肝郁脾虚状态机体出现食少、腹胀、便溏等脾胃失于健运的主要内在的中枢调节机制,7天模型组各指标较正常组增加不明显,表明慢性制动束缚7天,模型以肝郁样改变为主。2灌服逍遥散后,下丘脑ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白与基因的表达水平较模型组大鼠降低,表明ob-R及调节的下行POMC/CART通路可能作为传统中药逍遥散疏肝健脾以调节脾胃功能作用的靶点。