电纺PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架在组织工程皮肤中的实验研究

皮肤移植是覆盖大面积烧伤及皮肤缺损创面的重要手段,成功的皮肤移植对烧伤感染、休克的预防和创面愈合、愈后及生活质量都至关重要。现常采用异种移植、异体移植及自体移植等方法进行修复,但由于免疫排斥、供皮区有限等问题已经限制了其临床应用,所以目前多应用真皮替代物治疗。但真皮替代物缺乏血管结构,血管化过程慢。并且缺乏抗感染能力,所以移植成活率低。因此,研究和制备具有快速血管化能力及持续抗感染能力的能够模拟皮肤细胞外基质的生理结构的真皮替代物,对解决大面积烧伤及各种原因所致的皮肤缺损具有十分重要的意义。 静电纺丝技术制备的聚合纳米纤维支架结构,经大量实验证实可模拟细胞外基质结构,原料来源广泛,包括天然蛋白分子和合成高分子材料,并且能够按照需要的生物学功能预先设计,制备出具有各种功能的仿生组织支架结构,所以在生物医学领域已经成为主导技术。为构建兼具抗感染及快速血管化能力的真皮替代物,本研究从材料的选择入手,选用一种具有抗菌活性,并且兼具促进创面愈合功能的天然蛋白---壳聚糖,由于壳聚糖很难单独电纺制备,所以将其与无毒、纤维成型性良好、生物相容性好、可降解的高分子材料—聚乙烯醇(PVA)作为复合材料共电纺制备真皮替代物支架结构。 本研究中,首先确定电纺制备参数：高压静电为15千伏,固化距离为20厘米,壳聚糖：PVA质量比例为1：500,成功构建了PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架结构。扫描电镜结果显示纤维表面光滑,纤维的直径分布均匀,直径在200nm-300nm之间,并且具有较高的孔隙率及较高的比表面积。但该材料体系是否能满足组织工程皮肤所需的要求还尚未可知,因此我们对构建的PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架与PVA纳米纤维支架进行对比,在体内外降解行为、抗菌活性及对新生组织修复影响三个方面进行了评价。 (1)PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架与PVA纳米纤维支架的体内、外降解行为研究。体外降解试验采用标准的PBS (pH 7.4)溶液,37.0℃恒温水浴箱中温育,于温育后3天、7天及第14天后取出样本,干燥样本真空条件下喷金后扫描电镜分析。体内降解试验采用Wistar大鼠皮下埋置样本,在术后3、7、14、及28天,两组各个时间点分别随机取6只大鼠,取样本活检,行H&E染色观察。 (2)PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架与PVA纳米纤维支架的抑菌活性研究。采用抑菌试验法和细菌穿透试验法进行材料体系的抑菌能力检测。并且在抑菌活性检测后对样本进行扫描电镜分析,观察纤维支架的形貌变化。 (3)PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架与PVA纳米纤维支架对新生组织修复影响的研究。将PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架与PVA纳米纤维支架膜包裹在异种脱细胞真皮基质外层,构成一种“三明治式”复合真皮替代物。将纯异种脱细胞真皮基质和两“三明治式”复合真皮替代物组通过移植Wistar大鼠皮下,在术后3、7及14天,三组各个时间点分别随机取6只大鼠,取样本活检,对异种脱细胞真皮基质内行血管内皮细胞CD31的险测；将PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架组行Masson's trichrome染色,观察支架结构与新生组织替代过程；对PVA纳米纤维支架组和PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架组行血管内皮细胞CD31免疫组织化学染色,以观察新生组织内血管形成情况。 试验获得以下主要结果和结论： (1)在体外降解结果显示两组纤维支架形貌变化均十分显著,从纤维溶胀到纤维间“溶解”黏连,最终到纤维表面“断裂”及消失。在体内降解结果显示两组结构变化从结构完整性失去到结构松散,边界不清,有部分结缔组织纤维长入,最终纤维支架仅有小块残留,大部分已经被降解吸收。H&E染色结果均未见移植区明显的炎性细胞浸润及异物巨细胞形成。 (2)抑菌活性研究结果表明,PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架组对于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌均具有抑菌活性。对样本扫描电镜分析结果显示,纤维轮廓不清,孔隙不均匀,但仍可见纤维纵横交错的三维结构,表面存在细菌残骸。 (3)三组异种脱细胞真皮基质血管内皮CD31免疫组织化学染色结果表明,PVA纳米纤维支架组异种脱细胞真皮基质血管内皮数多于其他两组,具有统计学意义(P<0.05)。PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架组与PVA纳米纤维支架组行血管内皮CD31免疫组织化学染色结果表明,PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架组新生血管密度高,差异具有统计学意义(P<0.05)。PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架组Masson's trichrome染色结果显示,随着细胞成分在支架结构中的长入,新生胶原成分也不断合成,自身的纳米纤维支架结构也逐渐降解消失,最终被新生组织所代替。 结论：PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架具有良好的生物相容性、恰当的降解速度、优良的抑菌活性及明显的促进组织修复能力。本研究为最终构建具有真正意义的抗感染及促血管化能力的纳米三维组织工程皮肤支架进行了有效探索。