苦马豆素(swainsonine, SW)是豆科黄芪属和棘豆属有毒植物(疯草)的主要有毒成分,其分子质量小,化学本质为多羟基吲哚里西啶生物碱。由于疯草分布广泛,国内外在疯草的危害、有毒成分、毒理机制、防除和利用等方面的研究取得了重要进展,但目前,对SW免疫毒理学的研究还未广泛展开。SW是α-甘露糖苷酶抑制剂,通过抑制细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶Ⅰ的活性,影响糖蛋白的代谢,导致细胞空泡变性;根据SW可抑制高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性,国外学者对其抗肿瘤和免疫调节活性进行了研究,发现其医用前景广阔。了解SW与机体免疫功能之间的关系及弄清其影响免疫功能的细胞和分子机制,无疑将为SW的抗肿瘤临床应用和毒性作用机理研究提供理论依据,同时也将对疯草资源的合理利用起到现实指导意义。
本研究首先从变异黄芪中提取SW,然后以小鼠为实验动物,初步探讨SW与小鼠免疫功能之间的关系。为研究SW影响小鼠免疫功能的细胞和分子机制,试验采用淋巴细胞转化增殖试验MTT法、流式细胞术、ELISA法、NOS酶法、化学比色法以及吞噬杀伤试验,检测了正常小鼠和环磷酰胺所致免疫抑制小鼠在灌服不同剂量SW后,淋巴细胞增殖效果、T细胞亚群的变化、腹腔巨噬细胞吞噬杀伤活性以及在免疫应答调节中起重要作用细胞因子TNF-α、H2O2分泌量和NOS活性的变化,结果如下:
1.从变异黄芪中提取出SW,提取率为25 mg/kg;提取物经高压气相色谱测得SW纯度为98.17%。
2.给小鼠灌服5个不同剂量的SW生理盐水溶液,每天1次,连续21 d,研究SW与小鼠免疫功能之间的关系。结果发现,SW剂量为6.4 mg/kg时,小鼠免疫器官胸腺和脾脏指数减小;外周血液中白细胞、红细胞、淋巴细胞、粒细胞数减少,血红蛋白含量降低;血清中TNF-α与H2O2分泌量减少,NOS活性降低;病理组织学发现肝脏、脑、脾脏、肾脏组织细胞中出现空泡变性,表明SW剂量达到6.4 mg/kg时对小鼠具有一定的免疫毒性。SW低于6.4 mg/kg剂量时,病理组织学检查小鼠肝脏、脑、脾脏和心肌细胞排列整齐,结构清晰,未见异常;且SW在0.2～0.8 mg/kg之间,可以提高小鼠胸腺和脾脏指数、血液中白细胞和淋巴细胞数、血红蛋白含量,血清中TNF-α和H2O2分泌及NOS活性增强。
3.用血清溶血素试验检测SW对小鼠血清抗体溶血素的影响。结果发现,SW在0.05～3.2 mg/kg剂量范围内,小鼠血清溶血素值没有变化;SW在6.4 mg/kg时,血清溶血素值下降。表明低剂量SW不会引起小鼠特异性体液免疫反应,剂量达到6.4 mg/kg时可引起特异性体液免疫活性降低。
4.用淋巴细胞转化试验MTT法检测SW体外对淋巴细胞增殖活性的影响。取正常小鼠脾脏淋巴细胞,用不同浓度SW单独作用及协同丝裂原刺激下,测定淋巴细胞的增殖效果。结果表明,在SW浓度为0.2μg/mL,其单独或协同ConA、PHA-P作用时,能够刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖;SW协同LPS作用时,对其增殖活性没有影响。SW浓度为4μg/mL时,淋巴细胞的增殖均受到抑制。
5.用淋巴细胞转化试验MTT法检测SW体内灌服后,对正常小鼠和环磷酰胺所致免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖能力的影响。结果发现,SW单独作用或协同ConA、PHA-P刺激时,SW在0.2～0.8 mg/kg剂量范围内,正常小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性增强;SW剂量为0.8 mg/kg时,可以拮抗免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖活性,但未能使其增殖活性恢复到正常水平;SW协同LPS刺激时,淋巴细胞增殖活性变化均不明显。SW剂量6.4 mg/kg时,其单独作用或协同各种丝裂原下,正常小鼠淋巴细胞增殖活性均受到抑制;免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖受抑制作用进一步加强。
6.用流式细胞术检测小鼠外周血液淋巴细胞数时发现,SW剂量为0.8 mg/kg或0.2 mg/kg时,可以显著提高正常小鼠或免疫抑制CD3+和CD4+T细胞数,CD4+/CD8+比值均增大。结果表明,外周血液中CD3+和CD4+T淋巴细胞数和CD4+/CD8+比值的变化,与SW改善小鼠特异性细胞免疫功能有关。
7.对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能检测结果发现,SW剂量在0.2～0.8 mg/kg之间,能提高正常小鼠和免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬中性红和杀伤肿瘤细胞的活性,并能刺激巨噬细胞培养上清液中TNF-α和H2O2的分泌及NOS活性,表明低剂量SW可以通过提高NOS活性介导巨噬细胞信号传递通路,促进TNF-α和H2O2生成,发挥其吞噬和杀伤功能。SW剂量在6.4 mg/kg时,对正常小鼠和免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能具有明显的抑制作用。
以上结果表明,SW对小鼠免疫功能的影响具有双向调节作用,该作用与SW的作用剂量密切相关;高剂量SW对小鼠的细胞免疫和体液免疫功能具有明显的抑制作用;低剂量SW主要通过改变小鼠特异性和非特异性细胞免疫功而发挥其免疫效应。
