双酚A缺氧环境下对血管内皮细胞和乳腺癌细胞的作用及相关机制研究

双酚A(BPA)是一类环境内分泌干扰物,具有模拟雌激素效应,并且在人们生活环境中被大量使用,近年来,BPA作为癌症风险因子受到广泛的关注。在缺氧微环境中,肿瘤的生长需要周围基质细胞的参与和支持,其中包括血管内皮细胞。由于大多数乳腺癌细胞和血管内皮细胞均为雌激素和生长因子敏感型,在外界雌二醇或类雌激素配体刺激下,它们之间可能存在共通的分子机制诱导相关生长因子表达和分泌,增强它们之间的相互作用,进而加快肿瘤进程。目前已有大量文献报道BPA能够促进正常机体细胞或肿瘤细胞的增殖,但在肿瘤微环境下同时关注存在相互作用的癌细胞和基质细胞的研究较少,机制也不明确。我们通过体内和体外模型评价BPA在缺氧微环境下对血管内皮细胞和乳腺癌细胞的生物学作用并探究其分子机制,寻找BPA作用的共同靶点,为阐明环境内分泌干扰物在肿瘤发生发展过程中所扮演的角色提供新思路。第一部分双酚A缺氧环境下对血管内皮细胞作用及相关机制目的:构建体外化学模拟缺氧环境,观察BPA刺激下对血管内皮细胞的生物学作用,探究并验证其中相关的分子机制。方法:氯化钴构建缺氧微环境;用CCK-8、伤口愈合实验、Transwell以及小管生成实验检测BPA刺激下对血管内皮细胞(VECs)增殖、迁移以及血管生成能力的影响;用蛋白质免疫印迹方法和实时荧光定量PCR检测BPA刺激下VECs的蛋白偶联雌激素受体(GPER)、缺氧诱导因子-1(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)转录和翻译水平表达情况;蛋白质免疫印迹方法检测BPA短期作用下快速信号通路PI3K/AKT/m-TOR和MAPK/ERK1/2的变化;免疫荧光以及免疫共沉淀、抑制剂以及基因敲低方法验证BPA长期作用下通过GPER、窖蛋白-1(Cav-1)和热激蛋白90(HSP90)蛋白之间相互作用活化缺氧诱导因子(HIF-1α)。结果:1)体外缺氧环境下,1μm的BPA可以显著提高血管内皮细胞的细胞活力,并能够诱导细胞增殖、迁移以及血管生成,GPER拮抗剂G-15预处理后,BPA诱导效果显著下降(P<0.05);2)BPA和GPER激动剂G-1通过刺激GPER表达升高,诱导HIF-1α及其下游靶基因VEGF表达(P<0.05),而敲低GPER和G-15能够显著缓解BPA的刺激作用(P<0.05),提示BPA可能是诱发相关生物学现象的原因;3)BPA短期刺激下可以通过诱导快速信号通路PI3K、AKT、m-TOR和ERK1/2的磷酸化,促进HIF-1α合成增加;长期暴露诱导GPER竞争性结合Cav-1,促使HSP90释放,进而抑制HIF-1α降解。ERK通路抑制剂U0126、m-TOR抑制剂Rapamycin、PI3K通路抑制剂Wortmanin、HSP90拮抗剂17-AAG、Cav-1抑制剂环糊精以及敲低HSP90和Cav-1都能显著抑制BPA对HIF-1α的调节作用,结果具有统计学意义(P<0.05)。结论:本章研究结果表明GPER作为BPA活化血管内皮细胞的靶向受体、HIF-1α/VEGF为靶效应因子,短期作用通过PI3K/AKT/m-TOR和MAPK/ERK1/2,长期暴露通过GPER/Cav-1/HSP90蛋白之间相互作用。第二部分双酚A缺氧环境下对乳腺癌细胞影响及相关机制目的:观察BPA刺激下对两种乳腺癌细胞系(GPER高表达和低表达)的生物学作用,证明BPA对肿瘤细胞的作用方式与血管内皮细胞相同。方法:CCK-8、伤口愈合实验检测BPA刺激下对Sk Br-3及MDA-MB-231细胞增殖、迁移能力的影响;蛋白质免疫印迹方法和实时荧光定量PCR检测BPA刺激下Sk Br-3、MDA-MB-231细胞的GPER、HIF-1α和VEGF转录和翻译水平表达情况;蛋白质免疫印迹方法检测BPA短期作用下快速信号通路PI3K/AKT/m-TOR和MAPK/ERK1/2的变化;免疫共沉淀方法验证BPA长期作用下通过GPER/Cav-1/HSP90蛋白之间相互作用活化HIF-1α。结果:1)体外缺氧环境下,1μm的BPA可以显著提高Sk Br-3和MDA-MB-231的细胞活力,并能够诱导细胞增殖和迁移,GPER拮抗剂G-15预处理后,BPA诱导效果显著下降(P<0.05);2)BPA和G-1通过刺激GPER表达升高,诱导HIF-1α及其下游靶基因VEGF表达(P<0.05),而G-15能够显著缓解BPA的刺激作用(P<0.05),可能是BPA诱发相关生物学现象的原因;3)BPA刺激下可以通过诱导快速信号通路PI3K、AKT、m-TOR和ERK1/2的磷酸化,促进HIF-1α合成增加;也能诱导GPER竞争性结合Cav-1,促使HSP90释放,进而抑制HIF-1α降解。结论:本章研究结果表明GPER同时作为BPA活化乳腺癌细胞Sk Br-3及MDA-MB-231的靶向受体、HIF-1α/VEGF为靶效应因子,激活HIF-1α的分子机制与血管内皮细胞相同。第三部分双酚A对细胞共培养和荷瘤小鼠的作用研究目的:体内体外模型验证BPA能够通过GPER同时诱导血管内皮细胞和乳腺癌细胞活化,增强细胞之间的相互作用,促进肿瘤生长,进一步探讨分子机制。方法:共培养和条件培养基模型检测BPA对乳腺癌和血管内皮细胞之间相互作用的影响;收集MDA-MB-231细胞构建荷瘤小鼠模型,BPA和G-15单独或共同干预四周,观察对照组和干预组肿瘤生长情况;蛋白质免疫印迹及免疫组化检测各组肿瘤组织GPER、HIF-1α和VEGF的表达情况;同时检测血管标志物CD34的表达,反应肿瘤组织血管生成情况。结果:1)通过共培养和条件培养基模型,BPA可以显著增强血管内皮细胞对肿瘤细胞的促增殖作用(P<0.05);2)BPA诱导小鼠肿瘤浸润区域血管生长并加快荷瘤生长(P<0.05),G-15可以削弱BPA的促进作用;3)BPA诱导荷瘤小鼠GPER、HIF-1α和VEGF表达增加,与体外实验结果一致。结论:本章研究内容表明体内实验结果与体外结果一致,BPA同时活化乳腺癌细胞和血管内皮细胞,以GPER为靶向受体、HIF-1α/VEGF为靶效应因子,促进细胞间相互作用,加速肿瘤进程。综上所述,实验结果为探究BPA对肿瘤进程机制研究提供新思路,同时扩展了GPER相关信号通路,为今后研究环境内分泌干扰物影响机体生理活动的分子机制提供新靶点。