基于工程菌的甘草HMGR、SQS和β-AS基因CNVs对其表达的影响研究

作为常用中药材,甘草在国内外需求量都很大。甘草主要次生代谢产物—甘草酸是甘草活性成分之一,具有抗衰老、抗炎、降压等药理活性。由于栽培甘草中甘草酸平均含量低于《药典》标准,不能满足需求,因此目前的甘草资源研究主要集中在提高甘草栽培药材中甘草酸含量,而找到提高含量方法的切入点又在于揭示甘草酸含量差异的分子机制。 基因拷贝数变异(CNVs)是近年来的研究热点之一,目前已发现其与一些人类复杂性疾病有密切关系。在植物研究中,利用转基因技术以及工程菌外源基因表达技术改变功能基因的拷贝数进而研究有效成分含量变化已经有大量报道。根据分子生物中心法则,基因拷贝数的变异理论上会引起蛋白产量的改变,从而影响酶蛋白的催化作用。因此CNVs有可能进一步揭示甘草酸含量差异的分子机制。 目前,植物CNVs主要通过转基因植物和酵母实现,但转基因植物存在培养时间长,遗传背景复杂等问题。相比之下,酵母菌由于既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特点,同时又具有真核生物蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等的功能,是比较理想的宿主。 因此,本论文拟通过构建分别含有HMGR、 SQS和β-AS基因不同拷贝数的毕赤酵母工程菌,利用RT-PCR技术研究含这些基因不同拷贝数工程菌的的基因表达量差异,从CNVs对基因表达的影响角度揭示甘草酸含量差异的基因表达机制。 本论文的主要结果如下： (1)构建了分别含有甘草HMGR、 SQS和β-AS基因的毕赤酵母工程菌：HMGR基因拷贝数为1、2、4、8、13、44；SQS基因拷贝数为1、2、4、10、16、47；β-AS基因基因拷贝数只有1个。 (2)建立了Real time PCR检测工程菌中甘草HMGR、 SQS和β-AS基因拷贝数的方法。 (3)工程菌中,HMGR基因不同拷贝数插入的菌株基因表达量有明显差异,其中4拷贝插入时基因表达量最大,44拷贝最低,最高为最低的3倍,说明HMGR基因CNVs对其表达有影响；SQS基因不同拷贝数插入的菌株基因表达量无显著差异,说明SQS基因CNVs并未对其表达产生影响；由于没有构建成功含有不同拷贝数β-AS基因的工程菌,未对其拷贝数变异的基因表达进行进行研究。