内质网应激介导棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡

背景:骨质疏松(Osteoporosis,OP)及与其相关的骨折的发病率和死亡率在世界范围内不断上升,已经成为威胁公众健康的重大问题。越来越多的研究发现,肥胖与骨质疏松的发生发展密切相关,可能是导致骨质疏松的另一危险因素。肥胖患者血清游离脂肪酸水平普遍增高,并且可以对包括成骨细胞在内的多种细胞产生脂毒性作用。成骨细胞是骨代谢的基础,其工作状态和相对数量的改变都可能引起骨代谢异常并最终进展为骨质疏松。因此,体内高脂环境引起的成骨细胞凋亡增多可能是肥胖患者发生骨质疏松的重要机制。棕榈酸为一种动植体内常见的高级饱和脂肪酸,已有研究发现,棕榈酸可以通过其脂毒性诱导成骨细胞凋亡,然而,其具体机制目前尚不明确。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可以通过CHOP途径、Caspase-12途径和JNK途径参与细胞凋亡进程,这些通路的激活可以通过下游一系列反应最终导致细胞凋亡的发生。因此,我们推测高脂环境,即棕榈酸的干预,可能通过内质网应激途径诱导成骨细胞凋亡从而导致骨质疏松的发生。为证实这一设想,我们拟建立棕榈酸诱导成骨细胞凋亡的模型,同时应用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)预处理细胞,进而探讨内质网应激在此进程中的作用。目的:建立棕榈酸诱导成骨细胞凋亡的模型,探讨内质网应激在棕榈酸诱导成骨细胞凋亡中的作用,为骨质疏松的治疗提供新的思路。方法:用含不同浓度棕榈酸(0,100,250,500μmol/L)的完全培养基分别孵育成骨细胞24h;选择棕榈酸敏感浓度500μmol/L孵育成骨细胞不同时间(0,6,12,24 h);用含500μmol/L棕榈酸的完全培养基干预成骨细胞24 h并应用内质网应激抑制剂4-PBA进一步验证棕榈酸对成骨细胞增殖和凋亡的影响。CCK-8法检测细胞增殖活力;Annexin V/PI双染色法流式细胞术检测细胞凋亡率;Real-time quantitative PCR检测各组细胞内质网应激相关基因GRP78、CHOP、Caspase-12m RNA的表达。结果:1、与对照组相比,100μmol/L棕榈酸干预成骨细胞24 h对其增殖率无明显影响(P>0.05),250μmol/L(P<0.05)和500μmol/L(P<0.01)浓度组成骨细胞增殖率均下降,且呈剂量依赖性。用500μmol/L的棕榈酸干预6,12,24 h后,细细胞增殖率明显降低且呈时间依赖性(P<0.01)。与500μmol/L棕榈酸组相比,用4-PBA预处理细胞后再加入500μmol/L的棕榈酸干预细胞24 h可在一定程度上提高细胞的增殖活性,差异有统计学意义(P<0.05)。2、与对照组相比,100μmol/L棕榈酸干预组细胞凋亡率无明显差异(P>0.05),而250μmol/L和500μmol/L棕榈酸干预成骨细胞24 h可明显增加细胞凋亡率(P<0.01)且呈剂量依赖性。用500μmol/L的棕榈酸干预成骨细胞6 h(P<0.05),12 h(P<0.01)和24 h(P<0.01)可显著升高细胞凋亡率,且呈时间依赖性。与500μmol/L棕榈酸组相比,用4-PBA预处理细胞后再加入500μmol/L的棕榈酸干预细胞24 h可在一定程度上降低细胞的凋亡率,差异有统计学意义(P<0.01)。3、与对照组相比,用250μmol/L和500μmol/L棕榈酸干预成骨细胞24 h后,CHOP和GRP78 m RNA的表达水平呈剂量依赖性增高(P<0.01),而Caspase-12 m RNA的表达水平则有所降低(P<0.05),100μmol/L浓度组各基因表达量无明显差异(P>0.05)。500μmol/L棕榈酸分别处理细胞6,12,24 h后,CHOP的表达水平呈时间依赖性增高(P<0.01),GRP78 m RNA的表达水平在12 h开始升高(P<0.05),24 h达到峰值(P<0.01),Caspase-12 m RNA的表达水平则在12 h达到峰值(P<0.05),24 h后开始下降(P<0.01)。用4-PBA预处理细胞则可在一定程度上逆转棕榈酸的以上作用结果,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1、棕榈酸可能通过内质网应激途径诱导成骨细胞凋亡。2、4-PBA可以通过抑制内质网应激在一定程度上减少棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡。