本课题组前期研究结果表明冠心病、血瘀证、血小板功能状态三者之间存在极其密切的内在联系,我们采用血小板差异蛋白组学的研究方法,筛查了冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证患者和健康对照人群的血小板差异功能蛋白,建立了冠心病血瘀证血小板差异蛋白表达谱。研究发现,血小板骨架蛋白凝溶胶蛋白(Gelsolin)是冠心病血瘀证与非血瘀证患者的血小板差异蛋白之一,其含量在冠心病血瘀证患者血小板中明显增多,提示血小板骨架蛋白的异常表达在冠心病血瘀证发生发展中可能起到关键作用。
梗死后心肌组织释放大量肌动蛋白微丝(F-actin)对内皮细胞和微血管产生毒害,血浆Gelsolin可切害(?)F-actin解聚成肌动蛋白单体(G-actin),并通过肝脏内皮网状系统清除体外而阻止这种细胞毒。前期课题组差异蛋白组学研究发现血小板Gelsolin与冠心病血瘀证明显相关,血小板无转录本信息,故我们推测血小板Gelsolin含量升高是由于血浆Gelsolin(?)肖耗而引起血小板骨架蛋白反应性重组,这种病理性升高进一步加速血小板活化、变形而参与冠心病血瘀证形成。
本研究拟通过冠心病血瘀证贫、富血小板血浆Gelsolin含量与血小板活化相关性对这一假说进行验证,并借助F-actin诱导血小板活化体外和急性心肌梗死大鼠体内血小板活化实验体系,研究Gelsolin参与血瘀证形成过程及赤芍川芎有效组分配伍对血小板Gelsolin重组的调控及对血小板聚集、活化的影响。本研究将为活血化瘀中药抗血小板活化提供一定实验依据。
本课题研究分为三部分：文献综述、临床研究和实验研究。
1.文献综述：本部分分别从凝溶胶蛋白和心血管疾病、活血化瘀方药和抗血小板治疗两个方面进行综述。
2.临床研究：包括以下两个部分。
研究一冠心病血瘀证血小板差异蛋白Gelsolin的临床鉴定
目的：分别应用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印迹法(WB),对冠心病血瘀证血小板差异蛋白Gelsolin进行临床鉴定。
方法：冠心病诊断参照1999年及2002年美国心脏病学会(ACC)／美国心脏协会(AHA)／美国医师学会及美国内科学会(ACP-ASIM)联合协定关于《慢性稳定性心绞痛诊疗指南》、《不稳定性心绞痛、无ST段抬高心肌梗死诊疗指南》。同时,参考中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的血瘀证诊断标准。筛选符合冠心病、血瘀证、健康人入选标准的冠心病血瘀证组、冠心病非血瘀证组和健康对照组各30例为研究对象。冠心病血瘀证和非血瘀证患者于冠脉造影前采血,健康对照者于清晨空腹状态下抽取静脉血7mL,前2mL弃用,梯度离心法分别获取富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。分别应用酶联免疫吸附法和蛋白免疫印迹法检测各组人群PRP和PPP的Gelsolin含量。
结果：冠心病血瘀证组、非血瘀证组和健康对照组在年龄、性别、体重指数且两疾病组在冠心病类型、冠脉病变支数、合并疾病和用药情况方面无显著性差异,具有可比性。与健康对照组相比,冠心病血瘀证组患者富血小板血浆中的Gelsolin含量显著性升高(P<0.01),贫血小板血浆中的Gelsolin含量明显降低(P<0.05),冠心病非血瘀证组患者贫血小板血浆中Gelsolin含量亦明显降低(P<0.05),富血小板血浆中Gelsolin含量无明显差异(P>0.05)；与冠心病非血瘀证组相比,冠心病血瘀证患者富血小板血浆中Gelsolin含量明显升高(P<0.05),贫血小板血浆中Gelsolin含量无明显差异(P>0.05)。酶联免疫吸附法和蛋白免疫印迹法检测结果一致。
结论：Gelsolin作为细胞骨架蛋白的重要组成部分,在冠心病血瘀证状态下,其在富血小板血浆和贫血小板血浆中的含量分布存在差异性,与前期血小板蛋白质组学研究结果相一致,可能参与了冠心病血瘀证的形成过程。
研究二血小板Gelsolin水平与冠心病血瘀证相关性研究
目的：研究血小板Gelsolin水平与冠心病血瘀证的相关性。
方法：纳入冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证患者各57例和健康对照组45例为研究对象。冠心病血瘀证和非血瘀证患者于冠脉造影前采血,健康对照者于清晨空腹状态下抽取静脉血12mL,前2mL弃用,梯度离心法分别获取富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。采用ELISA法分别测定PRP中Gelsolin含量及PPP中Gelsolin、肌动蛋白微丝(F-actin)及维生素D结合蛋白(DBP)的含量；采用流式细胞术(FCM)检测血小板胞浆Ca2+浓度及反映血小板活化程度的CD62p的表达。
结果：冠心病血瘀证组、非血瘀证组和健康对照组在年龄、性别、体重指数且两疾病组在冠心病类型、冠脉病变支数、合并疾病和用药情况方面无显著性差异,具有可比性。与健康对照组相比,冠心病血瘀证患者PRP中Gelsolin含量显著升高(P<0.01),冠心病血瘀证及非血瘀证患者PPP中Gelsolin含量明显降低(P<0.05), F-actin及DBP含量明显升高(P<0.01),血小板CD62p表达及胞浆钙离子浓度显著升高(P<0.01)。与冠心病非血瘀证组相比,冠心病血瘀证组患者PRP中Gelsolin含量及胞浆钙离子浓度明显升高(P<0.01),血小板CD62p表达明显增高(P<0.05),PPP中Gelsolin、F-actin及DBP含量无明显差异(P>0.05)。对冠心病血瘀证组患者血小板Gelsolin含量与血小板活化标志物CD62p的表达进行相关性分析,结果显示冠心病血瘀证组患者血小板Gelsolin含量与血小板活化标志物CD62p高度正相关(P<0.01)。
结论：血小板Gelsolin水平与冠心病血瘀证血小板活化水平高度相关,在冠心病血瘀证血小板活化过程中,细胞骨架蛋白含量也出现了不同程度的变化,集中体现在血小板Gelsolin和其靶蛋白F-actin的异常变化上,推测血浆Gelsolin含量降低与其因切割、清除F-actin而大量消耗有关,这种消耗引起血小板上的Gelsolin病理性重组,同时引起血小板钙离子内流增加,导致血小板变形能力增强而参与冠心病血瘀证的形成,因此血小板Gelsolin可能是冠心病血瘀证的特异性分子靶标之一。
3.实验研究：包括以下两个部分。
研究一赤芍川芎有效组分对F-actin刺激的血小板活化及血小板Gelsolin水平的体外干预效应研究
目的：研究F-actin体外刺激对血小板活化及血小板Gelsolin含量的影响,同时观察赤芍、川芎有效组分的体外干预效应
方法：以人水洗血小板作为研究对象,以不同浓度的F-actin作为体外血小板活化诱导剂,同时以花生四烯酸(AA)、二磷酸腺苷(ADP)以及凝血酶(Thrombin)作为阳性对照诱导剂。同时以赤芍川芎有效组分芍药苷和川芎嗪联合作为干预药物,以阿司匹林作为阳性对照药物。采用流式细胞术检测血小板活化标志物CD62p的表达,使用血小板聚集仪测定最大血小板聚集率,采用ELISA法测定血小板Gelsolin的含量。
结果：①低(2.5μmol/L)、中(5μmol/L)、高(10μmol/L)不同浓度的F-actin以及AA、ADP和凝血酶(Thrombin)均可引起血小板聚集率和血小板活化水平明显升高(P<0.05及P<0.01),且F-actin随浓度的不断增加其致血小板聚集和活化程度不断增高,呈现浓度依赖性。F-actin最大浓度(10μmol/L)时刺激的最大血小板聚集率与血小板活化水平与同浓度的AA、ADP及Thrombin刺激组无明显差异(P>0.05)。
②低浓度(2.5μmol/L)的F-actin、ADP及Thrombin的刺激对血小板gelsolin含量无明显影响(P>0.05),中(5μmol/L)、高(10μmol/L)农度的F-actin以及AA均可刺激血小板Gelsolin含量明显增高(P<0.05)。F-actin最大浓度(10μmol/L)时刺激的血小板gelsolin含量与同浓度的AA无明显差异(P>0.05)。
③川芎嗪和芍药苷联合体外可以明显抑制由同浓度的F-actin和AA诱导的血小板聚集和活化反应(P<0.05),与阿司匹林相比无明显差异(P>0.05)。水洗血小板预先用川芎嗪和芍药苷联合孵育后,再用F-actin或AA诱导,可明显降低血小板Gelsolin含量(P<0.05),但预先用阿司匹林体外孵育无此效应(P>0.05)。
结论：F-actin体外能够激活血小板导致其聚集、活化,且高浓度能够刺激血小板大量分泌Gelsolin,其效应与AA相似。赤芍、川芎有效组分芍药苷、川芎嗪体外联合应用对聚集、活化后的血小板具有明显抑制作用,同时能够明显降低活化后血小板Gelsolin的含量,而阿司匹林体外干预无此效应。
研究二赤芍川芎有效组分对急性心肌梗死大鼠模型血小板活化及血小板Gelsolin水平的干预效应研究
目的：研究赤芍、川芎有效组分对急性心肌梗死大鼠模型血小板活化及血小板Gelsolin水平的体内干预机制
方法：通过在体结扎前降支方法建立急性心肌梗死大鼠模型,以赤芍川芎有效组分配伍药物芎芍胶囊(XSC)作为干预药物,同时以阿司匹林及钙离子拮抗剂维拉帕米作为阳性对照药物,观察芎芍胶囊对模型大鼠血小板活化及血小板Gelsolin含量及其相关指标的干预效应。血浆梯度离心法获得大鼠PRP和PPP,使用ELISA法测定Gelsolin、F-actin、DBP、P-选择素以及CK-MB、cTnl的含量,使用流式细胞术测定大鼠血小板钙离子浓度,使用WB法测定梗死区心肌组织Gelsolin的蛋白表达。
结果：①模型大鼠结扎前降支3小时后心肌损伤标志物血清CK-MB、cTnI含量均显著增高(P<0.05),同时血小板活化特异性指标血浆P-选择素含量亦较假手术组显著升高(P<0.05)；XSC高剂量组能够明显降低模型组大鼠血清CK-MB、cTnI水平(P<0.05),同时能够降低血浆P-选择素、COX-1及TXB2水平(P<0.05),其效应与阿司匹林组无明显差异；
②模型组大鼠血浆F-actin含量显著增高(P<0.05)而血浆Gelsolin、DBP含量明显降低(P<0.05),同时血小板Gelsolin含量明显增高(P<0.05)；XSC高剂量能够明显降低模型组大鼠血小板Gelsolin以及血浆F-actin水平(P<0.05),同时能够使血浆Gelsoin以及DBP含量显著升高(P<0.05)；模型组及XSC高剂量组大鼠血小板Gelsolin与血小板活化标志物P-选择素水平均呈正相关(P<0.05)。
③模型组大鼠血小板钙离子荧光强度明显增强(P<0.05),XSC高剂量能够明显抑制模型大鼠血小板钙离子内流(P<0.05),其效应与维拉帕米无明显差异(P>0.05)。
④模型大鼠梗死区心肌组织Gelsolin蛋白表达明显增强,而XSC可以明显抑制其表达,但钙拮抗剂维拉帕米无此效应。
结论：赤芍川芎有效组分能明显降低血小板Gelsolin水平,增强血浆肌动蛋白清除系统活性,抑制血小板活化,同时具有一定的钙拮抗效应,且在抑制COX-1活性、降低TXB2水平方面与阿司匹林相似。同时,经相关性分析发现,赤芍川芎有效组分抑制血小板活化程度与降低血小板Gelsolin含量有关。
