石菖蒲多糖抑制破骨细胞生成的分子机制研究

目的:探究石菖蒲多糖对抑制激活核因子kappa B受体（RANK）的配体（RANKL）诱导的破骨细胞生成的分子机制及其对LPS刺激的小鼠急性骨丢失症状的抑制效果。方法:（1）取骨髓来源的单核巨噬细胞,利用M-CSF诱导其分化成为骨髓巨噬细胞。（2）利用噻唑蓝比色法（MTT）检测不同浓度的石菖蒲多糖对破骨细胞前体细胞活性的影响。（3）利用不同浓度的石菖蒲多糖作用于两种刺激因子（M-CSF、RANKL）作用下的骨髓巨噬细胞,通过TRAP染色法检测石菖蒲多糖对破骨细胞形成的影响,初步确定石菖蒲多糖的有效药物浓度。（4）将不同浓度的石菖蒲多糖作用于种植在骨仿生培养板上的RANKL刺激下的骨髓巨噬细胞,利用VonKossa染色法检测石菖蒲多糖对骨吸收功能的影响,并利用荧光染色法检测石菖蒲多糖对RANKL刺激下的骨髓巨噬细胞的细胞骨架蛋白（F-actin）的影响,进一步验证石菖蒲多糖对破骨细胞骨吸收活性的影响,筛选出石菖蒲多糖影响破骨细胞细胞骨架结构的有效药物浓度。（5）将石菖蒲多糖作用于RANKL刺激下的骨髓巨噬细胞,收取第1天到第4天的RNA样品,利用荧光定量PCR检测TRAP、OSCAR、整合素αvβ3、ATP6V0d2、MMP9和CtsK的mRNA含量,评价石菖蒲多糖对于破骨细胞生成及功能相关基因的影响。（6）将石菖蒲多糖作用于RANKL刺激下的骨髓巨噬细胞,分别收取1、2、3、4天的RNA样品与蛋白样品,分别通过荧光定量PCR与WB两种方式检测石菖蒲多糖对破骨细胞生成的关键转录因子NFATc1与c-Fos在转录水平和蛋白水平表达的影响。（7）将石菖蒲多糖放入RANKL刺激下的骨髓巨噬细胞中培养,利用WB检测石菖蒲多糖对MAPK中JNK,ERK,p38蛋白及磷酸化蛋白表达情况,评价石菖蒲多糖对破骨细胞模型中MAPK信号通路的影响。（8）将石菖蒲多糖作用于RANKL刺激下的骨髓巨噬细胞,利用WB检测石菖蒲多糖对NF-κB家族IκB-α/GAPDH,p-p65/p65蛋白表达的影响,评价石菖蒲多糖对破骨细胞模型中NF-κB信号通路的影响。（9）将石菖蒲多糖作用于RANKL刺激下的骨髓巨噬细胞,利用WB检测石菖蒲多糖对影响NFATc1翻译后修饰的信号通路,即Ca2+信号通路中p-PLCγ2/PLCγ2,PP2B-Aα/GAPDH表达的调控作用,并利用检测细胞内Ca2+变化情况,评价石菖蒲多糖对破骨细胞模型中PLCγ2/Ca2+信号通路的影响。（10）将LPS诱导的骨丢失模型鼠进行石菖蒲多糖灌胃处理,设置盐水组、LPS组、高浓度加药组与低浓度加药组,分别利用石蜡组织切片与Micro-CT扫描观察并测量骨组织变化,评价石菖蒲多糖对LPS诱导的小鼠骨丢失模型的影响。结果:（1）15.625μg/m L-250μg/m L浓度区间的石菖蒲多糖对破骨细胞没有细胞毒性。（2）石菖蒲多糖呈浓度依赖性抑制破骨细胞生成,125μg/m L与250μg/m L效果较好,能够用于后续实验。（3）石菖蒲多糖31.25μg/mL-250μg/mL呈浓度依赖性抑制破骨细胞骨吸收活性。（4）石菖蒲多糖62.5μg/m L-250μg/m L均能抑制破骨细胞F-actin环的生成,且125μg/mL与250μg/m L效果较好,所以后续实验药物浓度使用125μg/mL。（5）石菖蒲多糖在1-4天均可以抑制TRAP、OSCAR、整合素αvβ3、ATP6V0d2、MMP9和CtsK的基因表达,说明石菖蒲多糖可以抑制由RANKL引起的破骨细胞生成及功能相关基因的表达。（6）无论是在蛋白水平还是在转录水平,石菖蒲多糖对于由RANKL引起的NFATc1与c-Fos的表达增加都有抑制作用,说明石菖蒲多糖可以抑制破骨细胞分化的关键转录因子的表达。（7）石菖蒲多糖对与由RANKL引起的ERK1/2、JNK、p38的磷酸化效果没有抑制作用,说明石菖蒲多糖不是通过抑制MAPK信号通路调节破骨细胞分化。（8）石菖蒲多糖对由RANKL引起的IκB-α的降解及p65的磷酸化没有抑制效果,说明石菖蒲多糖不是通过抑制NF-κB信号通路从而抑制破骨细胞生成。（9）石菖蒲多糖可以抑制由RANKL引起的PLCγ2及PP2B-Aα的活化,并且减缓由RANKL引起的Ca2+震荡,说明石菖蒲多糖是通过抑制PLCγ2/Ca2+信号通路抑制破骨细胞生成。（10）石菖蒲多糖可以减弱由LPS引起的小鼠腿骨骨小梁密度降低以及其离散度增加,但对于骨体积没有影响,说明石菖蒲多糖是通过调节骨小梁的密度及离散度来保护由LPS引起的骨丢失症状,并不是通过调节骨量。结论:石菖蒲多糖通过PLCγ2/Ca2+/PP2B-Aα信号通路抑制破骨细胞形成及骨吸收活性;石菖蒲多糖能够保护由LPS刺激的骨丢失症状。