黄芩及其提取物对甲型流感病毒核蛋白表达的体外实验研究

目的：探讨黄芩及黄芩提取成分对甲型流感病毒核蛋白基因（NP基因）表达的影响，和对核蛋白（NP）表达的影响，为寻找新的抗流感病毒中药提供实验依据。 方法：本实验首先采用细胞病变法（CPE）确定各种药物的实验浓度；然后将真核重组质粒pcDNA3.1（+）/NP通过脂质体介导瞬时转染到HeLa细胞中，将成功转染的HeLa细胞作为靶细胞，转染后48h，取细胞培养上清液，采用胶体金免疫层析试纸法测NP蛋白的表达；取转染后的细胞提取RNA，合成cDNA，采用荧光定量RT-PCR法测NP基因的起始核酸量。本实验设HeLa细胞组、空质粒转染组(转染pcDNA3.1（+）)、脂质体组、重组质粒转染组(转染pcDNA3.1（+）/NP)、黄芩水煎剂组、黄芩总黄酮组、黄芩苷组和黄芩素组，共八组。 结果：采用细胞病变法得出各种药物对HeLa细胞的无毒界限分别为：黄芩水煎剂：3906.25μg·ml-1，黄芩总黄酮：0.9765625μg·ml-1，黄芩苷：62.5μg·ml-1，黄芩素：31.25μg·ml-1；药物的实验浓度分别为：黄芩水煎剂：1953.125μg·ml-1，黄芩总黄酮：0.48828125μg·ml-1，黄芩苷：31.25μg·ml-1，黄芩素：15.625μg·ml-1。转染48h后，取细胞培养上清液，采用胶体金免疫层析试纸法测得NP蛋白表达：重组质粒转染组、黄芩总黄酮组、黄芩苷组、黄芩素组为阳性，细胞对照组、脂质体组、空质粒转染组和黄芩水煎剂组为阴性；从转染后的细胞中提取RNA，合成cDNA，并进行荧光定量RT-PCR测试，得到一条标准曲线：Y=-3.455X+48.119；根据标准曲线方程计算出各组的NP基因起始核酸量分别为：细胞对照组：（0.6613±0.1020）×10～5copies·μl-1，空质粒转染组：（0.2520±0.0946）×10～5copies·μl-1，脂质体组：（0.4750±0.1943）×10～5copies·μl-1，重组质粒转染组为（81.4500±29.6597）×10～5copies·μl-1，黄芩水煎剂组：（29.6250±7.6596）×10～5copies·μl-1，黄芩总黄酮组：（61.0250±25.3261）×10～5copies·μl-1，黄芩苷组：（27.7250±12.8484）×10～5copies·μl-1，黄芩素组：（31.8250±8.2152）×10～5copies·μl-1。采用t检验对数据进行统计学分析，重组质粒转染组与细胞对照组比较，t=5.448，P=0.012＜0.05，具有统计学意义；与空质粒转染组比较，t=5.475，P=0.012＜0.05，具有统计学意义；与脂质体组比较，t=5.460，P=0.012＜0.05，具有统计学意义；与黄芩水煎剂组比较，t=3.384，P=0.015＜0.05，具有统计学意义；与黄芩总黄酮组比较，t=1.047，P=0.335＞0.05，不具有统计学意义；与黄芩苷组比较，t=3.324，P=0.016＜0.05，具有统计学意义；与黄芩素组比较，t=3.225，P=0.018＜0.05，具有统计学意义。 结论：黄芩水煎剂能够抑制甲型流感病毒NP基因和NP蛋白的表达。黄芩总黄酮对甲型流感病毒NP基因和NP蛋白的表达无影响。黄芩苷和黄芩素能够下调甲型流感病毒NP基因起始量。