大肠湿热证实质及郁金散对其治疗作用机理研究

大肠湿热证(Large Intestine Dampness-heat Syndrome,LIDHS)系指湿热蕴结大肠致大肠传导失司所表现以泄泻下痢为主的一系列证候。为畜禽和人类临床常见多发证,见于湿热型腹泻性疾病中。在现代畜禽养殖业中,腹泻性疾病是困扰现代畜禽养殖的顽疾之一,而湿热型腹泻是其最主要的类型,随集约化养殖和畜禽流动性的增加,猪、牛和鸡等畜禽中湿热型腹泻性疾病呈明显上升趋势。对人类而言,随社会经济的发展多种因素容易损伤脾胃气机,进而诱发大肠湿热证。郁金散(YuJin Powder,YJP)为中兽医临床治疗大肠湿热证的常用经典方剂。中兽医临床实践表明,郁金散对湿热型腹泻性疾病有较好的治疗效果。为研究大肠湿热证的实质及郁金散对其治疗作用的机理,本研究通过设置复合因素,模拟发病条件,建立大鼠大肠湿热证模型,应用高、中、低剂量郁金散进行治疗。首先进行临床病理学研究,然后对大肠湿热证最主要病变部位回肠和结肠进行肠黏膜屏障研究,并进一步对病变程度更高的结肠进行蛋白质组学研究,最后用血清代谢组学方法对大肠湿热证表现出的全身性病理变化进行探讨。主要研究方法和结果如下:1.临床病理学研究Wistar大鼠60只,雌雄各半,随机分为6组,每组10只:正常对照组、模型组、自愈组、郁金散高剂量组、郁金散中剂量组、郁金散低剂量组。通过设置高糖高脂、饥饱失常、高温高湿、饮酒和腹腔注射大肠杆菌等复合因素,模拟其发病条件,建立大肠湿热证大鼠模型;模型复制成功后用高、中、低剂量郁金散进行治疗。然后对各组大鼠的症状体征、血常规、血生化、全血粘度、血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17和IL-23水平以及结肠、回肠、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等各主要脏器的病理变化进行了检测和观察。结果显示,模型大鼠的临床症状、体征与大肠湿热证诊断标准相吻合,且机体出现了血脂血黏度升高、脂肪肝、明显的炎症反应及多脏器的瘀血病理变化。各剂量郁金散治疗后均可改善其临床症状和体征,回调血常规、血液生化及血清炎性因子水平,降低全血粘度,减轻各脏器的病理变化,并呈现出一定的剂量效应关系,且以高剂量治疗效果最好。2.肠黏膜屏障研究对正常对照组、模型组、自愈组和高剂量郁金散组各组大鼠,通过组织病理学方法观察结肠和回肠黏膜完整性,实时荧光定量PCR法检测结肠和回肠组织中TFF3、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表达量,ELISA法检测血清中二胺氧化酶(dao)、d-乳酸(d-la)和内毒素(et)、结肠和回肠黏液中的siga及结肠和回肠组织中炎性细胞因子tnf-α、il-1β、il-6、il-10、il-17和il-23水平变化,并应用illuminamiseq高通量测序技术分别对正常对照组、模型组和高剂量郁金散组大鼠粪便中的微生物菌群进行16srdnav3-v4区高通量测序,并分析了alpha多样性、物种组成和丰度、菌群结构等。结果显示,相比正常对照组,模型大鼠结肠和回肠上皮完整性遭受破坏,occludin和zo-1显著降低(p<0.01或p<0.05),tff3极显著升高(p<0.01),而muc2在回肠和结肠中变化不同,血清中dao、d-la和et的含量均显著升高(p<0.01);siga显著升高(p<0.05);促炎因子tnf-α、il-1β、il-6、il-17和il-23显著或极显著升高(p<0.05或p<0.01),抑炎因子il-10显著或极显著降低(p<0.05或p<0.01)。经郁金散治疗后,各项指标均趋于或者接近正常水平。从正常对照组、模型组和高剂量郁金散组鉴定到的细菌覆盖13个门、20个纲、28个目、46个科和75个属。在门分类水平上,均以拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门为优势菌门,但丰度在三组之间存在显著差异。相比正常对照组,模型组中拟杆菌和变形菌的丰度显著升高(p<0.05),而厚壁菌丰度显著降低(p<0.05)。经郁金散治疗后,变形菌门和厚壁菌门丰度发生显著回调,拟杆菌变化较小。在科分类水平上,与正常对照组相比,模型组中紫单胞菌科、脱硫弧菌科、sutterellaceae、拟杆菌科、丹毒丝菌科、氨基酸球菌科、肠杆菌科、odoribacteraceae和螺杆菌科的丰度均升高;而普雷沃氏菌科、毛螺旋菌科、瘤胃菌科、优杆菌科和乳杆菌科的丰度却均下降。经高剂量郁金散治疗后,除普雷沃氏菌科的丰度与模型组相比继续升高外,其它各科细菌丰度均显著回调(p<0.05)。3.结肠组织蛋白质组学研究选取病变最严重的部位结肠组织,采用基于itraq的定量蛋白质组学技术检测分析模型组和正常对照组及高剂量郁金散组和模型组大鼠结肠组织的差异蛋白,并分析差异蛋白参与的通路。结果显示,模型组和正常对照组之间共筛选出152种差异蛋白,其中84种上调,68种下调。进一步路径分析表明脂肪消化和吸收、ampk信号路径、氧化磷酸化、视黄醇代谢、iga产生的肠免疫网络、fcepsilonri信号路径、补体和凝集级联放大反应、花生四烯酸代谢等在大肠湿热证大鼠模型中受到显著影响。经郁金散治疗后,与模型组相比共有221种蛋白发生显著变化,其中139种上调,82种下调,并且对大肠湿热证模型大鼠55种差异蛋白表现出直接的回调作用,以上异常路径得到显著改善。4.血清代谢组学研究对正常对照组、模型组和高剂量郁金散组大鼠血清分别用uplc-qtof-ms/ms技术进行代谢组学检测,采用progenesisqi软件进行数据预处理,使用MetaboAnalyst对预处理后的数据进行单变量分析和模式识别多变量分析。根据差异倍数(Fold change,FC)≥1.5或≤0.677,q-value<0.05以及PLS-DA模式下的VIP≥1的原则分别筛选模型组和正常对照组之间及高剂量郁金散组和模型组之间的差异代谢物,然后对差异代谢物进行相关性分析和热图聚类分析。将获得的差异代谢物分别输入KEGG数据库查找相关代谢通路。结果显示,模型组和正常对照组共筛选出41种差异代谢物,包括牛磺酸、牛璜鹅去氧胆酸、L-肉碱、L-乙酰肉碱、油酰胺、甘油-3-磷酸、马尿酸、磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酰胆碱类等,主要涉及脂类代谢、己糖胺合成通路、苯丙氨酸代谢及色氨酸代谢。治疗组和模型组共筛选出20种差异代谢物,包括D-葡萄糖、D-乳酸、β-羟丁酸、甜菜碱、硬脂酰肉碱、溶血磷脂酰胆碱类等,主要涉及脂肪分解、脂肪酸β-氧化,色氨酸代谢和苯丙氨酸代谢。本研究证明,通过模拟发病条件,成功建立了大肠湿热证大鼠模型,其实质主要体现在以下四个方面:(1)其主要临床症状为腹泻,主要的病变部位在回肠和结肠,以回肠和结肠黏膜损伤、炎症和瘀血,并伴发全身性的炎症和淤血为其最典型的病理特征;(2)典型病变部位回肠和结肠的肠黏膜机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障均受到不同程度破坏;(3)大肠湿热证发生的关键是由脂质代谢紊乱、微循环和能量代谢障碍、视磺醇代谢紊乱以及生物因子等诱发消化道免疫网络失调、稳态被破坏,使机体处于过敏状态而导致肠道损伤与炎症反应;(4)胆酸合成与胆汁分泌、脂肪合成与分解、磷脂代谢、花生四烯酸代谢等脂类代谢,己糖胺合成通路,苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢通路等发生紊乱与大肠湿热证的发生关系密切。郁金散对大肠湿热证的治疗主要体现在:(1)发挥了抗腹泻、抗炎、降血脂、缓解血瘀以及调节和保护多脏器等综合作用;(2)修复了肠黏膜的机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障;(3)调控了脂质代谢、微循环和能量代谢、视黄醇代谢、消化道免疫网络和稳态;(4)加强了脂肪分解、脂肪酸β-氧化、葡萄糖有氧氧化,调控了色氨酸代谢和苯丙氨酸代谢等。本研究为揭示大肠湿热证的实质提供了重要信息,为大肠湿热证的临床用药提供了指导;为寻找湿热型腹泻性疾病的靶点、扩大郁金散的临床应用、开发治疗腹泻性疾病的药物奠定理论基础。