灰树花(Grifola frondosa)是担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、非褶菌目、多孔菌属中的一种大型药食用真菌,其子实体富含氨基酸、多糖、微量元素等多种营养成份。灰树花多糖有调节免疫力、抗肿瘤、治疗糖尿病、改善体内脂肪代谢及抗氧化等多种生物学功效。目前对灰树花深层发酵多糖的研究还比较少;本文研究了灰树花液态发酵,优化了发酵培养基组成,并进行扩大培养;通过不同的提取方式提取灰树花菌丝体多糖;灰树花多糖纯化、结构信息的表征;多糖的抗氧化作用的研究。研究结果如下:
1.通过单因素试验确定了灰树花液态发酵培养基的碳源和氮源种类,筛选出对灰树花多糖合成影响显著的三个培养基组分为:葡萄糖,酵母粉和菜籽油。响应面分析结果表明,在培养基组成为葡萄糖27.15g/L,酵母粉5.9g/L和菜籽油3.66g/L时,获得最大菌丝体量4.93 g/L;而在培养基组成为葡萄糖25.85g/L,酵母粉5.56g/L和菜籽油3.34g/L时,最大胞外多糖量为1.89 g/L。在优化培养基组成的条件下5 L发酵罐扩大培养,扩大培养后的菌丝体产量最大值达5.5g/L,胞外多糖量最大值2.1 g/L,大于优化前菌丝体的产量。
2.对灰树花菌丝体多糖提取进行了研究,探讨了热水、超声及微波法提取灰树花多糖的工艺。研究三种提取工艺的料水比、提取时间、提取温度等因素对灰树花菌丝体多糖提取率的影响。在单因素的基础上,对热水提取、超声提取及微波提取法正交试验优化。结果显示热水提取条件为料水比为1:15,时间为4h,温度为95℃时,提取率达到最大为3.98%。超声提取条件为料水比为1:10,时间为45min,温度为70℃时,提取率达到最大为4.36%。微波提取条件为料水比为1:20,时间为12min,功率为600W时,提取率达到最大为4.74%。对比三种提取工艺可以看出采用微波提取灰树花菌丝体多糖的提取率最高。
3.通过水提、脱蛋白、透析、醇沉,DEAE-52及Sephadex G-75层析方法从灰树花菌丝体中获得多糖GFPⅠ-Ⅰ,以及灰树花深层发酵的胞外多糖组分WGFPⅠ-Ⅰ。经GC分析灰树花多糖GFPⅠ-Ⅰ、胞外多糖组分WGFPⅠ-Ⅰ以葡萄糖为主要单糖组分。紫外可见光谱、红外光谱、气相色谱及核磁对灰树花多糖的一级结构的基团及它的一些结构特点的分析表明,多糖GFPⅠ-Ⅰ可能的结构为[α-D-Glc(1→4)-]n型葡聚糖,平均分子量为7.3×104;多糖WGFPⅠ-Ⅰ可能的结构为[α-D-Glc(1→4)-]n型葡聚糖,并且有[α-Glc(1→3)-]n支链结构,平均分子量为5.66×104。
4.分别对灰树花菌丝体多糖和胞外多糖体外、体内抗氧化试验,研究多糖的还原力、DPPH·体系中的抗氧化性、清除超氧阴离子和羟基自由基能力,以及体内抗D-半乳糖诱导小鼠衰老试验。结果表明灰树花多糖随着浓度的增大还原力增强;灰树花菌丝体多糖浓度达到0.4mg/mL时其清除O2·-的能力达到80%,胞外多糖浓度达到0.4mg/mL时其清除O2·-的能力达到90%。灰树花菌丝体、胞外多糖浓度为1.0mg/mL时其抑制羟基自由基大小为70%。多糖对DPPH·的清除能力随着多糖浓度的升高有增大的趋势,特别是菌丝体多糖,当浓度达到1.0mg/mL时,清除DPPH·的能力达到了67%。小鼠体内实验表明,与模型组相比,灰树花菌丝体多糖及胞外多糖可以显著提高脑、肝、心脏组织和血清中T-AOC、GSH-Px、SOD活性(P<0.05),尤其以胞外多糖更为显著;同时灰树花多糖可以显著降低肝脏、心脏组织和血清中MDA含量(P<0.01),对脑组织则没有明显效果。
