睡眠剥夺大鼠脑内IL-1β和NGF表达及药物干预的影响

近些年来，白介素-1β（Interleukin-1 beta，IL-1β）、神经生长因子（nervegrowth factor，NGF）及核因子-kB（nuclear factor-kappa B，NF-kB）与睡眠剥夺所致脑功能障碍的关系已引起关注，有关研究文献日益增多，但国内尚缺乏相关研究。本文采用大鼠完全睡眠剥夺（total sleep deprivation，TSD）模型，应用免疫组化、Western-blot及RT-PCR方法，检测海马和皮质IL-1β和NGF蛋白及其mRNA的表达，探讨它们与睡眠的关系；检测NF-kB和抑制性亚单位-a（inhibitory subunit-a，IkB-a）的变化，探讨它们与IL-1β和NGF转录之间的关系；以盐酸纳洛酮进行干预，探讨其对大鼠学习记忆功能的影响。 第一部分 睡眠剥夺对大鼠海马和皮质IL-1β蛋白及其mRNA表达的影响 目的 研究完全睡眠剥夺对大鼠海马和皮质IL-1β蛋白及其mRNA表达的影响。方法 将大鼠放入1转／分钟转笼中，制作经历不同持续时间的完全睡眠剥夺（TSD）模型。60只大鼠分为免疫组化（n=30只）及RT-PCR（n=30只）两大组，每大组再随机分为5小组：对照组（正常对照CC组，环境对照TC组）和睡眠剥夺组[TSD6h组，TSD1d组，TSD3d组（n=6只）]。分别采用免疫组化和RT-PCR方法检测大鼠海马和皮质IL-1β蛋白及其IL-1βmRNA。结果 免疫组化结果显示：IL-1β主要分布在细胞浆，胞核内也有表达；阳性细胞体积较小，成卵圆形，梭形或三角形，胞浆浓染，突起少，大多为中神经元及一些胶质细胞，主要分布在海马CA3、CA1及齿状回细胞核和细胞浆，在大脑皮质分布于各层。RT-PCR法结果显示，在海马CA3区，TSD6h组和TSD1d组IL-1βmRNA的表达明显高于对照组，TSD3d组更为明显；在CA1区TSD6h组表达也明显增多。结论 完全睡眠剥夺大鼠海马和皮质IL-1β蛋白及其mRNA表达增高，且随时间的延长而逐趋明显。睡眠短期剥夺IL-1β的增高可能对脑细胞具有应激性保护作用，而长期剥夺后IL-1β持续增高可能对神经元有损伤作用。 第二军医大学博士论文 第二部分睡眠剥夺对大鼠海马和皮质NGF蛋白及其.RNA表达的影响 目的研究完全睡眠剥夺对大鼠海马和皮质NGF蛋白及其mRNA表达的 影响。方法动物分组、模型制作及免疫组化和Rf-PCR的操作步骤同第一部 分。应用免疫组化方法检测睡眠剥夺大鼠海马和皮质的NGF蛋白，应用R不PCR 方法检测NGF mRNA。结果免疫组化结果显示，海马CAI区仆D组NGF 较对照组有增高趋势，但差异不明显。在C八3区铭D6h组明显低于对照组， 而铭D3d组明显高于对照组。结论完全睡眠剥夺可导致大鼠皮质NGF的表 达变化，短期睡眠剥夺使NGF的表达减少，剥夺时间延长则表达增加。NGF 表达增加可能对神经起到营养保护作用，对受损神经元有修复作用。 第三部分睡眠剥夺大鼠海马和皮质11产IB及NGP口RNA调控的可能机制 目的通过观察纳洛酮对睡眠剥夺大鼠海马和皮质NF一kB和玫B一a蛋白合 成的影响，探讨几1B和NGF转录调控的机制。方法共64只大鼠，实验前 先进行丫迷宫训练3天，后给以完全睡眠剥夺。再将大鼠随机分为纳洛酮卿ai) 干预及生理盐水对照（Ns）两大组。再各分为”D4组。断头后取脑组织，用 节阳stem一blot检测NFkB和玫B一蛋白，用RrpCR方法检测压IB和NGF的 mRNA。结果在皮质区，NsTsD6h组NF-kB蛋白量较Nsl’C组明显增加，而 铭Dld组及铭D3d组均较巧D6h组降低，但与TC组比较仍明显增加。NalTSD6h 组和Nai铭D3d组水平较对应NsTSD组明显减少。皮质区NsTsD6h组及 NsTSD3d组压B一a蛋白量较TC组明显减少。Nal两组玫B一a蛋白较对照组明显 增加。在海马，NsTSD6h组和NsTSD3d组NF一kB水平均较对照组明显增高; Nal仆D6h和NaiTSD3d组均较Ns组明显降低。NsTSD6h组和NsTSD3d组IkB一a 较对照组明显减少，其余各组比较无明显差异。皮质区N下.kB和IkB一a的表达 与ILIB和NGF的mRNA相关;而在海马区N下.kB与IL18mRNA呈正相关， 与NGF]吐RNA不相关。结论睡眠剥夺大鼠内源性压IB及NGF的mRNA表 达增加，可能参与诱导NF-kB激活，而后者的激活与玫B一a被磷酸化而降解有 关。NTkB激活后又可能对压IB的表达进行调控。 第四部分盐酸纳络酮对睡眠剥夺大鼠学习记忆功能的影响 目的研究睡眠剥夺大鼠学习记忆功能障碍及盐酸纳洛酮干预后的影响。方 第二军医大学博士论文 法实验动物为实验第三部分用药后断头前的睡眠剥夺大鼠，用药方法见第三 部分。应用丫迷宫检测大鼠的学习记忆能力，主要观察指标为反应潜伏期及正 确反应率。实验记录指标:每次进行丫迷宫的准确率及逃避潜伏时间，每只大 鼠共训练20次，结果以（无，s）表示。结果丫迷宫实验结果潜伏期及准确率与 第一部分中海马皮质压1B蛋白表达及压18和NGF mRNA转录变化相一致. 结论纳洛酮能影响学习记忆功能，使睡眠剥夺大鼠丫迷宫实验的潜伏期缩短， 正确反应率增高。纳洛酮的作用机制可能与其抑制正B一a的磷酸化，使N下.kB 的活性降低，影响压1B的基因转录，从而抑制压lB表达有关。因此，纳洛酮 能改善剥夺睡眠所致的认知功能障碍。