龙眼胚性培养物胞质型apx基因克隆及其表达研究

本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)“红核子”胚性愈伤组织(Embryogenic callus,EC)体胚发生同步化调控而获取的各主要发育阶段胚性培养物以及经过NaCl、光、温度等逆境胁迫处理的龙眼LC2胚性愈伤组织为材料,进行如下研究:①在已有3′端序列基础上,采用同源克隆技术克隆胞质型apx基因5′端序列以获得完整的ORF;②进行胞质型apx基因的原核表达;③进行龙眼胚性培养物APX活性测定;④建立龙眼APX同工酶电泳分析方法,分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物以及逆境胁迫处理下龙眼EC的APX同工酶变化;⑤克隆龙眼胚性培养物中看家基因(β-actin),利用荧光定量PCR技术分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物以及逆境胁迫处理下龙眼EC胞质型apx基因转录水平表达变化。主要研究结果如下: 1.龙眼胚性愈伤组织胞质型apx基因5′端序列克隆与cDNA全长序列获得 以龙眼EC为材料,采用5′RACE方法,在已经获得的3′序列基础上设计反式引物,结合通用引物,进行巢式PCR,经过引物筛选和条件优化得到500 bp左右的特异条带。经测序发现该目的片段与已知3′序列有250 bp左右的重合序列,将二者拼接,得到1027 bp目的序列。该序列与登录Genbank的其它植物胞质型apx基因有很高的同源性。序列分析发现拼接的cDNA含有一个753 bp的开放阅读框,编码251个氨基酸。推导的氨基酸序列与植物胞质型APX高度同源。经过分析,753 bp的开放阅读框中不含有内含子。 2.龙眼胞质型apx基因原核表达 根据拼接得到龙眼apx全长cDNA的序列分析,在可能的ORF区域设计一对添加限制性内切酶的特异引物,进行ORF片段扩增并将其克隆到表达载体pET-29a中。将构建好的表达载体在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行融合表达。经过诱导,SDS-PAGE分析发现宿主菌中有一个分子量约为28 kD的新蛋白出现。该诱导表达的蛋白分子量与理论推导龙眼胞质型APX的分子量27.7 kD相符。 3.NaCl、光和温度胁迫下龙眼胚性愈伤组织APX酶活性变化 在光、NaCl和温度胁迫处理下,龙眼胚性愈伤组织中APX酶活性均存在明显变化。本研究发现,与对照相比,三种逆境胁迫都可不同程度的诱导APX活性增加;推测APX活性变化与胚性细胞抗逆性正相关。 4.龙眼体胚发生过程不同阶段培养物和逆境胁迫处理下龙眼EC的APX同工酶变化 本研究在APX同工酶提取、电泳、染色等几个方面进行了摸索,建立了一套适合分离龙眼胚性培养物APX同工酶的垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法。并利用此方法分析龙眼体胚发生过程不同阶段培养物和逆境胁迫处理下龙眼EC的APX同工酶变化。发现在龙眼体胚发生这一氧化胁迫过程中,APX同工酶随胚性细胞分化会有酶谱带消失和新增,不同发育阶段存在明显差异。在三种逆境胁迫处理下,龙眼EC中APX同工酶随胁迫条件的不同也会有酶谱带消失和新增。这些结果表明龙眼胚性细胞对氧化胁迫的应答不是依靠一种APX酶单独作用,而是多种APX同工酶一起协同作用。 5.龙眼胞质型apx基因转录水平表达分析 本研究从龙眼胚性愈伤组织中克隆到895 bp的β-actin基因3′端序列,做为实时荧光定量PCR技术分析胞质型apx基因表达变化的参照。分析结果显示,在龙眼体胚发生过程中,不同分化程度的胚性培养物的胞质型apx基因在转录水平的相对表达量均较胚性愈伤组织高,在紧实球形结构阶段相对表达量最大,之后在球形胚和子叶形胚阶段其相对表达量又有所降低。龙眼胚性愈伤组织温度胁迫下的分析结果显示,温度胁迫可诱导胞质型apx基因表达量增加,且低温诱导的增加趋势较高温明显。但在40℃时,apx基因相对表达量最大。