选题依据:黄芩为唇形科植物Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根,其性寒味苦,具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效,是山西大宗药材。山西黄芩占全国产量的40%以上,然而目前主要的利用方式仍是简单初加工的原药材,提取、深加工的不到1%,附加值很低。黄芩提取物是黄芩经提取纯化制得的粉末,药典规定其黄芩苷含量不得少于85.0%。目前市场上有各种不同规格的黄芩提取物,广泛用于制药、化妆品、兽药等领域。在制药行业,主要以黄芩苷含量大于85%和90%的黄芩提取物为原料,其中,以黄芩苷含量大于85%的黄芩提取物,即85%黄芩提取物为原料的制剂有茵栀黄制剂、银黄制剂和清开灵制剂等共8种,以黄芩苷含量大于90%的黄芩提取物,即90%黄芩提取物为原料的制剂有清开灵注射液等,这些制剂均为中药大品种,市场销量极大,用量可观,可见85%和90%黄芩提取物的市场需求量很大。因此对黄芩苷含量大于85%和90%两种规格的黄芩提取物进行研究具有重要意义。目前对黄芩提取物的研究较多,但是仍存在如下问题:①原料药材黄芩采收期不明且评价指标单一,质量难以控制;②现有制备工艺步骤繁琐,产品回收率低,对环境污染极大,缺乏一种快速、高效、环境友好型的制备方法;③提取物标准单一,中国药典只收录85%黄芩提取物的质量标准,缺乏差异化的质量控制方法。本论文将针对上述问题进行研究。目的:1.比较不同采收期黄芩的质量,确定其最适采收期,为不同规格黄芩提取物的原料来源提供参考。2.分别建立85%和90%两种规格黄芩提取物的制备工艺并对其进行工艺验证。3.分别建立85%和90%两种规格的黄芩提取物相对应的质量标准,规范不同规格产品质量。方法:1.以一年生和两年生不同采收期黄芩为实验对象,采用UPLC-MS/M代谢组学手段检测其化学成分种类和含量的动态变化规律,寻找并指认差异代谢物,确定黄芩提取物原料药材的最适采收期。2.以黄芩苷含量和出膏率为评价指标,比较几种不同提取方法和溶剂的提取效果,在选定的最优提取方法及溶剂的条件下,进一步采用单因素试验优选各参数最佳水平,确定黄芩提取工艺;以产物中黄芩苷含量和收率为评价指标,考查并比较酸沉、大孔树脂纯化、高速逆流分离(HSCCC)等方法的纯化效果,不同纯化工艺和提取工艺联用,分别建立85%和90%两种规格黄芩提取物的制备工艺,确定两种规格提取物的工艺路线,并对工艺进行验证。3.对所确定两种制备工艺制备而得的两种规格黄芩提取物建立其相对应的质量标准,以测定的数据确定标准限度。质控指标包括水分、炽灼残渣、薄层鉴别、含量测定等。结果:1.建立了基于UPLC-MS/MS的黄芩植物代谢组学方法,对一年生和两年生不同采收期黄芩的化学成分种类和含量随采收季节的动态变化规律作了研究,结果表明不同采收季节的黄芩化学成分差异明显,并呈规律性的变化,黄芩苷、汉黄芩苷等黄酮苷类成分含量从春季到夏季、秋季呈"降低-升高-再降低-再升高"的变化趋势,黄芩素等苷元类成分含量变化则与苷类相反,发生了"升高-降低-再升高-再降低"的变化,虽然二类成分含量的变化趋势明显不同,但含量最终均在冬初(10月)恢复到接近春末(4月)时的含量水平。综合黄芩中各化学成分随生长发育过程的含量变化规律,规定:若以黄芩素等黄酮苷元类成分为目标成分,建议采收时间为5月;若以黄芩苷等黄酮苷类成分为目标成分,则建议最佳采收时间在8月;另外,黄芩苷为不同规格黄芩提取物的主要成分,在4月和8月份含量达到最大值,因此规定本研究所用黄芩提取物原料药材最佳采收时间为4月和8月。2.确定了85%黄芩提取物的制备工艺为:取黄芩,70%EtOH80℃回流2次,每次1.5h,滤过,合并两次滤液,加6mol/L的盐酸调pH至1.0,在80℃下保温60min,常温静置12h,离心,沉淀分别用水及50%EtOH、95%EtOH洗至pH为中性,挥尽EtOH,60℃烘干,即得。3.建立了两条90%黄芩提取物的制备工艺路线:工艺路线一为:取黄芩,70%EtOH 80℃回流提取2次,每次1.5h,滤过,合并两次滤液,60℃烘干得提取物粗膏,将粗膏溶于水中,上样于HPD100型大孔柱,首先以4倍柱体积(BV)的水除杂,然后以3BV 50%EtOH洗脱,收集50%EtOH组分,减压回收溶剂得大孔树脂粗提物,将所得大孔树脂粗提物进样于乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水(4:1:0.5:6,v/v/v/v)HSCCC系统中进行高速逆流纯化,根据色谱仪检测器采集的图谱收集各组分,合并黄芩苷组分,即得,该路线操作简单,生产周期短且纯化产物回收率高,纯度高,相比于传统制备方法,避免了产生大量酸水,对环境友好,安全性好,但由于HSCCC技术目前尚未实现大规模工业化应用,因此本路线可作为一种实验室制备黄芩提取物的方法;工艺路线二为:取黄芩,pH为4～5的70%EtOH80℃回流提取2次,过滤,合并滤液,用盐酸调节pH至1.0,80℃保温1h,常温静置,离心,沉淀分别用适量水及50%EtOH、95%EtOH洗至中性,挥尽EtOH,减压干燥,将所得粉末溶于水,上样HPD100大孔柱,依次用水、50%EtOH洗脱,收集50%EtOH组分,减压干燥,即得,该路线操作简单,避免了目前工艺中的两步调酸法,减轻了环境污染,重复性高,可操作性强,适于工业化生产。4.建立了一种新的黄芩苷含量测定方法和两种不同规格黄芩提取物的TLC鉴别方法,规定按干燥品计,85%黄芩提取物的水分含量不得过4.04%,炽灼残渣不得超过0.48%;90%黄芩提取物的水分含量不得过3.92%,炽灼残渣不得超过0.53%。结论:1.本论文建立了基于UPLC-MS/MS的黄芩植物代谢组学方法,对不同采收期黄芩的质量进行了比较,确定了黄芩最佳采收期,为黄芩提取物的原料采收提供了参考。2.分别建立了 85%和90%两种规格黄芩提取物的制备工艺并分别进行了工艺验证,工艺均稳定、可行,相比于传统制备工艺更加节能高效且环境污染小。3.分别建立了 85%和90%两种规格的黄芩提取物的质量标准,所制定的标准高于药典标准,为规范不同规格产品质量提供了依据。
