IRAK1在结直肠肿瘤发生中的作用及乌梅丸防治的机制研究

目的:阐明IRAK1在结直肠肿瘤发病过程中的作用机制并探讨乌梅丸在此过程中的防治功效。方法:1.通过检索GEO数据库探讨IRAK1在正常肠组织、腺瘤组织、腺癌组织中的表达情况。利用临床样本验证IRAK1及其磷酸化蛋白正常肠组织、腺瘤组织、腺癌组织中的表达情况。利用Western Blot检测各个肠癌细胞系中IRAK1的表达水平,并根据各细胞IRAK1蛋白表达水平选取HCT116、RKO细胞进行研究。利用慢病毒转染在HCT116细胞系中构建IRAK1过表达和敲低的稳转细胞株,在RKO细胞系中构建IRAK1敲低的稳转细胞株。利用Western Blot验证IRAK1在HCT116及RKO稳转细胞株中的蛋白表达水平。利用CCK-8实验研究IRAK1在体外对人肠癌细胞活力的影响;利用克隆形成实验研究IRAK1在体外对人肠癌细胞增殖能力的影响。利用IRAK1抑制剂进行CCK-8及克隆形成实验,研究药理学抑制IRAK1对细胞增殖的影响。利用流式细胞技术,IRAK1在体外对人肠癌细胞凋亡及细胞周期的影响,利用Western Blot检测IRAK1对细胞周期相关蛋白的表达影响。利用IRAK1抑制剂检测研究药理学抑制IRAK1对肠癌细胞凋亡及周期的影响。2.利用基因富集分析挖掘IRAK1在腺瘤组织中的潜在功能。筛选出IRAK1促进结直肠肿瘤发生的可能机制为调控MYC表达。利用CO-IP、qPCR、Western Blot以及临床数据验证作用关系。在HCT116和RKO细胞系中利用IRAK1抑制剂15409及c-Myc抑制剂10058-F4,通过CCK-8以及克隆形成实验明确IRAK1是否通过调节c-Myc而影响肠癌细胞增殖。利用Western Blot筛选IRAK1下游通路因子变化相关情况,挖掘IRAK1调控c-Myc的可能途径。利用p38抑制剂SB203580验证挽救实验中抑制p38对过表达IRAK1以后c-Myc的改变情况。在HCT116和RKO细胞系中利用IRAK1抑制剂15409及p38抑制剂,通过Western Blot和qPCR验证IRAK1对MYC的调控是否依赖p38。利用p38抑制剂及c-Myc抑制剂,通过CCK-8以及克隆形成实验明确p38是否通过调节c-Myc而影响肠癌细胞增殖。利用c-Myc抑制剂通过Western Blot检测c-Myc对IRAK1激活的影响。3.液相色谱法获得复方乌梅丸的代表性成分,通过分子对接运算,挖掘其中可能作用于IRAK1的成分。建立以氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠肠道肿瘤模型,探讨乌梅丸以及IRAK1抑制剂15409对其的缓解作用。计算各组小鼠生存情况、肠道成瘤数量以及肿瘤大小,通过HE染色验证肠道病理改变。Western Blot检测IRAK1/p38/c-Myc在各组小鼠肠组织中的表达情况。建立DSS诱导的小鼠肠炎模型,通过结肠长度以及HE染色评估乌梅丸以及IRAK1抑制剂对肠炎的缓解作用。Western Blot检测IRAKl/p38/c-Myc在各组小鼠肠组织中的表达情况。利用GEO数据库验证IBD患者肠组织中IRAK1和MYC表达的相关性。结果:1.多个 GEO 数据库(GSE117606、GSE37364、GSE41258 以及GSE71187)证实IRAK1在正常组织、腺瘤、腺癌中的表达逐渐升高(P<0.05)。同时含有腺瘤和腺癌的患者,其正常组织、腺瘤、腺癌中IRAK1及其磷酸化表达均逐渐升高(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线分析TCGA的肠癌数据显示IRAK1过度表达的肠癌患者总生存期短(Log-rank P<0.05)。,HCT116过表达IRAK1的细胞株中IRAK1表达明显高于载体对照组。HCT116以及RKO敲减IRAK1的细胞株中IRAK1表达明显低于载体对照组。IRAK1过表达增加了 HCT116的细胞活力,而在HCT116及RKO中不同的IRAK1干扰片段均抑制了细胞活力(P<0.05)。IRAK1过表达增加了 HCT116的克隆形成率,而在HCT116及RKO中不同的IRAK1干扰片段均抑制了克隆形成(P<0.05)。IRAK1抑制剂15409抑制HCT116及RKO的细胞活性(P<0.05)。15409抑制HCT116及RKO的细胞克隆形成(P<0.05)。与载体对照比较,IRAK1的敲减不会影响HCT116及RKO的凋亡率。IRAK1过表达后HCT116细胞G2期比例下降,而IRAK1干扰后HCT116及RKO细胞周期阻滞在G2期(P<0.05)。IRAK1过表达的HCT116细胞CyclinB1、CDK1的表达升高,P21的表达降低。IRAK1干扰后的HCT116及RKO细胞CyclinB1、CDK1的表达降低,P21表达升高。15409干预HCT116及RKO细胞不会影响HCT116及RKO的凋亡率。15409干预HCT116及RKO细胞细胞周期阻滞在G2期(P<0.05),降低CyclinB1、CDK1的表达,升高P21表达。2.GSEA分析GEO数据库腺瘤组织中IRAK1的表达情况在MYC靶标相关基因集显著富集。临床样本免疫组化检测证实大肠腺瘤组织中IRAK1与c-Myc的表达高度正相关(P<0.05)。CO-IP证实在HCT116和RKO细胞中IRAK1及c-Myc蛋白存在相互作用关系。IRAK1过表达的HCT116细胞系中MYC水平升高,而敲减IRAK1的HCT116及RKO中MYC表达降低(P<0.05)。HCT116和RKO细胞中,15409降低了 c-Myc蛋白表达,并且这种作用被MG132逆转。15409和10058-F4均降低HCT116及RKO细胞活性(P<0.05);15409联合无法进一步增加10058-F4的效果。15409和10058-F均减少HCT116及RKO克隆形成(P<0.05);I5409联合也无法进一步增加10058-F4的效果。IRAK1过表达的HCT116中p38被激活,而P65无明显改变,ERK1/2被抑制;IRAK1敲减的HCT116中p38及P65均受到抑制,ERK1/2活性无明显改变;IRAK1敲减的RKO中p38、P65及ERK1/2活性均受到抑制。SB203580能够逆转IRAK1过表达引起的c-Myc升高。15409或SB203580均能降低HCT116及RKO中MYC的mRNA及蛋白表达。SB203580及10058-F4均降低HCT116及RKO细胞活性(P<0.05);SB203580 联合无法增加 10058-F4 的效果。SB203580 及 10058-F4均减少HCT116及RKO克隆形成(P<0.05);SB203580联合无法增加10058-F4抑制的效果。10058-F4处理的HCT116及RKO细胞中IRAK1表达下降,p38活化受抑制。3.质谱鉴定乌梅丸中含量稳定的11个化学成分包括柠檬酸、小檗碱、黄柏碱、药根碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、6-姜酚、羟基-α-山椒素、细辛脂素、阿魏酸。其中柠檬酸、小檗碱含量较高。分子对接结果提示黄连中的小檗碱以及黄柏中的黄柏碱能结合IRAK1的磷酸化位点T387。成功构建AOM/DSS诱导的肠肿瘤模型。6g/kg乌梅丸口服能明显提高模型动物的生存率。减少了肠道肿瘤的数量(P<0.05),同时也能减小肿瘤的体积(P<0.05);药理学抑制IRAK1并不能减少肿瘤的发生,但是显著降低了肿瘤的体积(P<0.05)。6g/kg乌梅丸有效缓解了造模导致的肠粘膜破坏。显示模型小鼠IRAK1在Thr387处活化,同时伴有c-Myc及p38的激活,乌梅丸以及IRAK1抑制能降低激活的IRAK1、p38以及c-Myc。DSS诱导急性肠炎模型发中乌梅丸以及IRAK1抑制均能改善造模导致的结肠长度改变(P<0.05)。病理提示药物干预能减轻粘膜损坏情况。模型小鼠IRAK1在Thr387处活化,同时有p38的激活,模型小鼠肠组织c-Myc表达降低。各组药物均能降低激活的IRAK1以及p38。IBD数据集GSE3629以及GSE75214中样本表达IRAK1及MYC均高度正相关。结论:结直肠肿瘤发生过程中IRAK1通过激活p38上调MYC表达从而促进肿瘤增殖。乌梅丸通过抑制IRAK1起到防治结直肠肿瘤的作用。