3种植物多糖抗猪蓝耳病病毒及免疫增强作用研究

猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS）是由猪蓝耳病毒（猪繁殖与呼吸综合征病毒,porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种以妊娠母猪流产、各种年龄猪（特别是仔猪）呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。PRRSV感染导致猪免疫功能低下,对其他致病因子的易感性增加。目前PRRS几乎遍及世界各养猪国家,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。对该病尚无有效的治疗方法,临床上主要使用PRRSV疫苗进行免疫预防。PRRSV弱毒苗免疫效果较好,但本身存在散毒危险,灭活苗虽然安全性较高,但由于引起的体液免疫应答不完全,导致免疫效率不高,且PRRSV的抗体依赖性增强作用（ADE）,可能会导致染毒猪长期持续性感染。因此提高疫苗免疫的保护性抗体水平和细胞免疫作用是防制PRRSV感染的关键。 多糖具有增强免疫、抗病毒等功能。本文选用板蓝根多糖（IRPS）、黄芪多糖（APS）和山药多糖（CYPS）分别进行了体外、体内抗病毒作用及免疫试验;从细胞水平、分子水平研究了其对PRRSV的免疫调节作用,初步揭示了3种植物多糖免疫调节作用的机理,为PRRSV疫苗免疫增强剂的筛选提供了理论依据。 1.采用现代的微波处理与传统的水煎醇沉相结合的方法从板蓝根、黄芪、山药中提取植物多糖,并用观察细胞病变（CPE）和中性红法研究了它们对PRRSV感染Marc-145细胞的影响。结果发现:板蓝根多糖、黄芪多糖和山药多糖的提取率(g·kg-1)分别为59.1、37.4和53.6,糖含量（%）分别为56.7、65.8和73.5。APS对PRRSV感染具有显著的阻断作用(在0.391 mg·mL-1～0.049 mg·mL-1),在较高浓度时具有显著的直接杀灭作用（P＜0.05）。IRPS对PRRSV感染具有显著的阻断作用(在0.196 mg·mL-1～0.024mg·mL-1安全浓度范围内)和直接杀灭作用（在较高浓度,P＜0.05）。CYPS在高浓度区(0.196mg·mL-1～0.098 mg·mL-1)可以有效阻断PRRSV对细胞的感染作用,对PRRSV无直接杀灭作用。表明这3种植物多糖均可阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染,但对侵入细胞后的PRRSV无抑制作用。 2.通过巨噬细胞吞噬功能、溶血素及溶血空斑试验研究了不同剂量的3种多糖对小鼠免疫功能的影响,结果证实3种植物多糖均能增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能,提高溶血空斑及溶血素水平。板蓝根多糖、黄芪多糖和山药多糖提高小鼠免疫功能的最佳剂量分别为20 mg·kg-1、30 mg·kg-1和50 mg·kg-1。 3.以板蓝根多糖、黄芪多糖和山药多糖作为免疫增强剂分别与PRRSV灭活苗、弱毒苗联合免疫仔猪,用ELISA方法检测免疫猪血清中抗PRRSV抗体水平,结果发现,同一种多糖对不同类型的疫苗免疫增强作用不同,其效果和剂量密切相关。板蓝根多糖高剂量对PRRSV灭活苗、弱毒苗均能提高免疫抗体水平;低剂量板蓝根多糖能提高PRRSV灭活苗、降低PRRSV弱毒苗免疫抗体水平。黄芪多糖能显著提高PRRSV灭活疫苗的免疫抗体水平,高剂量的效果较好;与PRRSV弱毒苗同时使用,能抑制PRRSV抗体产生,其抑制作用和剂量密切相关,剂量越大抑制作用越强,特别是在免疫的早期。山药多糖可显著提高PRRSV灭活苗免疫抗体水平,以低剂量效果较好,山药多糖与弱毒苗同时使用,会降低PRRSV抗体的水平。 4.研究了板蓝根多糖、山药多糖和黄芪多糖对体外培养的猪脾脏淋巴细胞增殖、以及分泌一氧化氮（NO）、IL-2、IL-4和IFN-γ的影响。结果表明:这3种植物多糖体外均能促进猪淋巴细胞的增殖,其作用具有一定的量效关系。黄芪多糖、山药多糖均能显著促进猪脾淋巴细胞NO的合成;板蓝根多糖高剂量抑制NO的合成,低剂量促进NO的合成。3种多糖均可提高淋巴细胞分泌IFN-γ的量,其中板蓝根多糖效果最好;3种多糖均有促进淋巴细胞分泌IL-4的功效,且黄芪多糖效果最好;3种多糖对IL-2的分泌均有抑制作用。这从细胞水平、分子水平揭示了多糖免疫调节的机制。 5.运用流式细胞技术检测了3种多糖对PRRSV疫苗免疫猪外周血T淋巴细胞亚群的影响,结果发现3种多糖和PRRSV灭活苗联合使用,均能促进猪CD3+细胞的增殖,其中以山药多糖和板蓝根多糖效果较好;3种多糖对CD4+细胞的增殖有一定的促进作用,其中以山药多糖低剂量组（CYPSL）、山药多糖高剂量组（CYPSH）和黄芪多糖高剂量组（APSH）效果较好;3种多糖均能促进猪CD8+细胞的增殖,其中以板蓝根多糖和山药多糖效果较好。3种多糖分别和PRRS弱毒苗联合使用,对猪外周血CD3+细胞、CD4+细胞的影响不显著;免疫早期可促进猪外周血CD8+细胞的增殖,其中以板蓝根多糖和黄芪多糖效果较好。多糖和不同类型疫苗联合使用,对T淋巴细胞亚群的影响不同。 6.用实时荧光定量PCR研究了3种多糖分别与PRRSV弱毒苗联合使用对猪外周血淋巴细胞中IFN-γmRNA表达的影响,结果发现:黄芪多糖和山药多糖与PRRSV弱毒苗联合使用在免疫的早期会抑制猪外周血淋巴细胞中IFN-γmRNA的表达,而板蓝根多糖对猪外周血淋巴细胞中IFN-γmRNA表达的影响和剂量密切相关,高剂量可以提高表达而低剂量则抑制表达。这从核酸分子水平揭示了多糖免疫调节的机制。