产漆酶杏鲍菇原生质体紫外线诱变育种及其发酵条件研究

杏鲍菇(Pleurotus erygii)又名刺芹侧耳,隶属于担子菌亚门(Basidio mycotina ), 层菌纲( Hymenomycetes ) , 无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae),伞菌目(Agaricales),侧耳科(Pleurotaceae),侧耳属(Pleurotus)。杏鲍菇菌肉肥厚,营养丰富,有降血压和降血脂的作用。(陈士瑜,陈海英,2000)。 杏鲍菇有多种胞外酶,漆酶(Laccasse)、过氧化物酶、芳基乙醇氧化酶(Aryl-alcohol oxidase,AAO)等,其中漆酶引起人们的大量关注。漆酶是一种含有4 个铜离子(Ⅱ)的胞外多酚氧化酶,属于铜蓝蛋白家族,普遍存在于白腐菌中。杏鲍菇降解木质素能力强,与所含漆酶活性高密切相关。C Mu?oz 等(C Mu?oz, F Guillén, A T Martínez,1997)纯化了两种杏鲍菇漆酶同工酶:漆酶I和漆酶Ⅱ。两者都是单体糖蛋白,碳水化合物含量分别为7%和1%,分子量(SDS-PAGE)分别为65kDa 和61kDa,pI 分别为4.1和4.2。Guillen F 等(Guillen F, Martinez AT, Martinez MJ,1992)也发现杏鲍菇培养物中有漆酶活性。从双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、美味侧耳(Pleurotus sapidus)、茶薪菇(Agrocy becylindracea)、肺形侧耳(Pleutotus pulmonarius)和香菇(Lentinula edodes)子实体中提取漆酶,用分光光度法测定酶活并同杏鲍菇漆酶相比,发现杏鲍菇漆酶活性最高。杏鲍菇发酵液中与木质素降解相关的氧化酶也是漆酶活性高峰出现最早。 原生质体技术在食用菌育种中具有重要意义。1972 年荷兰De Vessels首次用裂解酶分离了裂褶菌原生质体,随后又分离了双孢蘑菇和草菇的原生质体。1980 年以后,有关食用菌原生质体分离的报道大量增加(刘祖同,1999)。本文采用紫外线诱变原生质体技术,选育杏鲍菇高产漆酶菌株,并研究了所选育的变异株深层发酵培养的最佳发酵工艺条件及其所产漆酶的部分生物学性质,为杏鲍菇生产漆酶的应用提供了参考。 实验结果表明,杏鲍菇原生质体制备与再生的最佳条件为:在30℃、pH5.5、1.5%溶壁酶条件下,以0.6mol/L 甘露醇作为稳渗剂,酶解2.5h,原生质体产量达到2.90×107个/mL。将所得原生质体过滤、纯化、稀释后涂布再生培养基,再生率为0.18%。 紫外灯照射杏鲍菇原生质体不同时间,经过粗筛和精筛后,从中选出