1目的苍术具有强烈温燥之性,在临床上常见有口干、便秘等副作用,其燥性部位为挥发油。目前未见以挥发油考察苍术临床使用剂量的相关研究,为了明确苍术挥发油燥性的量效关系,确定苍术安全用量范围,本论文开展了苍术挥发油燥性效应量效关系相关研究,在此基础上,利用苍术燥性特点对腹泻型肠易激综合征的治疗作用进行相关探索,为进一步拓展苍术临床作用提供参考。2方法2.1苍术挥发油燥性效应量效关系研究以C57BL/6小鼠为研究对象,分为5个组别,每组15只,除空白对照组,其他组分别给与185、370、555、740 mg/kg剂量的苍术挥发油,灌胃给药14天,选择小鼠日均饮水量、日均尿量、肾脏AQP2表达量、脏器系数以及结肠SCF和c-kit基因的表达量为指标,考察各组小鼠燥性效应。2.2苍术挥发油对IBS-D大鼠药效学研究以SD大鼠为研究对象,分为5个组别,每组10只,分别为正常组,模型组,苍术挥发油93 mg/kg组、苍术挥发油370 mg/kg组,匹维溴铵组,除正常组外,其余各组均以乙酸灌肠并进行束缚刺激造IBS-D模型,实验过程中测量各组大鼠体重,粪便含水率,粪便Bristol等级评分;实验结束后,采用q RT-PCR方法检测大鼠结肠组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素10(IL-10),白细胞介素6(IL-6),水通道蛋白3,4,8(AQP3、AQP4、AQP8)的m RNA表达含量;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清和结肠组织中五羟色胺(5-HT)、血管活性肠肽(VIP)和P物质(SP)的含量,结合肠道病理切片进一步全面考察苍术挥发油治疗IBS-D的药效作用。2.3苍术挥发油对IBS-D大鼠的机制研究以SD大鼠为研究对象,分为5个组别,每组10只,分别为正常组,模型组,苍术挥发油93 mg/kg组,匹维溴铵组,除正常组外,其余各组均以乙酸灌肠并进行束缚刺激造IBS-D模型,实验结束后,采用q RT-PCR法检测大鼠结肠组织中SCF、c-kit、TNF-α、Occludin、ZO-1、MLCK、MLC2的m RNA表达水平;采用免疫印迹(WB)方法检测大鼠结肠组织中SCF、c-kit、TNF-α、ZO-1、Occludin、MLCK、p-MLC2的蛋白表达量;采用免疫组织化学(IHC)方法检测大鼠结肠组织中SCF和c-kit的蛋白表达量;采用免疫荧光(IF)方法分别进一步检测大鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达,并对MLCK/MLC2信号通路进行了检测,进一步明确苍术挥发油对腹泻型肠易激的作用机制。3结果3.1苍术燥性效应量效关系研究与空白组比较,苍术挥发油185 mg/kg、370 mg/kg组日均饮水量,尿量,肾脏AQP2平均光密度无显著性差异,结肠SCF基因的表达显著升高(P<0.01),185 mg/kg组结肠c-kit基因表达显著升高(P<0.01),370 mg/kg组无明显差异;555 mg/kg组除日均尿量、结肠c-kit基因的表达量显著性降低(P<0.01)外,其他指标无明显差异;740 mg/kg组饮水量显著性升高,尿量显著降低,肾脏AQP2的平均光密度值显著升高(P<0.01),结肠SCF和c-kit基因的表达显著下降(P<0.01)。3.2苍术挥发油对IBS-D大鼠药效学研究与模型组相比,苍术挥发油93 mg/kg组的体重明显上升,在粪便含水率和粪便Bristol等级评分方面,两者都有明显的下降,而苍术挥发油370 mg/kg组未见明显效果。另外,苍术挥发油93 mg/kg组和苍术挥发油370 mg/kg组均可以显著抑制炎症因子(TNF-α、IL-6)的水平,提高抑炎因子IL-10的表达。由肠道HE切片可以看出,苍术挥发油93 mg/kg组可以降低肠道炎症保护肠道损伤,在水通道代谢方面,93 mg/kg苍术挥发油可以提高水通道蛋白3和水通道蛋白8(AQP3、AQP8)的表达,但对AQP4没有明显影响,同样93 mg/kg苍术挥发油可以降低IBS-D大鼠血清和结肠组织中5-HT、VIP和SP的含量,但370 mg/kg苍术挥发油均未见显著效果。通过对苍术挥发油治疗IBS-D的研究表明,93 mg/kg苍术挥发油可以改善乙酸和束缚刺激导致的大鼠腹泻,还能够抑制大鼠体内炎症的发生,保护肠道损伤,调节肠道运动进而达到缓解治疗IBS-D的效果。3.3苍术挥发油对IBS-D大鼠机制学研究通过进一步对苍术挥发油抗IBS-D作用机制研究发现,苍术挥发油可以抑制大鼠结肠组织中SCF、c-kit的m RNA和蛋白的表达,达到调节IBS-D的肠道运动和炎症水平作用。在保护肠道损伤方面,苍术挥发油可以通过抑制TNF-αm RNA和蛋白的表达,抑制MLCK的m RNA和蛋白表达水平,从而抑制MLC2的磷酸化,防止细胞骨架松动,抑制紧密连接蛋白ZO-1和Occludin等其他跨膜蛋白被降解,促使紧密连接(TJ)变得紧密,从而达到保护肠道的作用。4结论本文通过对正常C57BL/6小鼠给予不同浓度的苍术挥发油,探究苍术挥发油产生燥性效应的量效关系以确定苍术挥发油安全给药剂量。在此基础上,以较全面的指标探究不同剂量的苍术挥发油对IBS-D的药效和作用机制,结果发现苍术挥发油可以显著改善IBS-D大鼠的腹泻症状,改善肠道组织病理变化,其机制是通过SCF/c-kit通路改善肠道运动和肠道炎症,并且通过MLCK/MLC2通路抑制紧密连接蛋白的减少从而达到保护屏障的作用。本实验结果为苍术的临床应用剂量提供实验参考,通过挖掘苍术燥性潜在治疗功能,为拓展苍术临床对疾病的治疗提供重要依据。
