以“饮片入药、生熟异治、辅料炮制”为特色的传统中药炮制理论是中医临床用药的重要内容,其中醋制法历史悠久、应用广泛。醋性温味酸,醋制中药可以引药入肝,增强活血祛瘀、理气止痛的作用。莪术为“醋制入肝”的代表性中药,其生品长于行气消积,醋制后主入肝经血分,临床主要用于肝癌、淤胆型肝及气滞血瘀等疾病的治疗。目前关于莪术炮制的研究主要集中于炮制工艺、炮制前后化学成分的变化、炮制前后活血化瘀、镇痛抗炎效应的变化,而关于炮制机理的研究报道较少。本课题来源于国家自然科学基金面上项目,前期研究发现莪术醋制后可显著提高细胞存活率;提高大鼠胆汁的排泄率;对CYP450酶亚型CYP1A2、CYP2E1具有抑制作用,对CYP3A4具有诱导作用;大鼠灌胃给予生、醋莪术饮片挥发油后,醋莪术组肝组织中莪术二酮的浓度比例有所提升;大鼠灌胃给予生、醋莪术姜黄素提取物后,醋莪术组姜黄素在肝组织中浓度最高。以上研究均在一定程度上阐释了莪术“醋制入肝”的效应及机制。中药炮制与归经理论研究是一项极其复杂而深奥的系统工程,应当多层次、多角度、多种方法结合进行研究。本课题在前期研究的基础上,紧扣中医药整体观理念,探索性采用现代新技术对醋制引起的莪术归经和功效变化的机制进行深入探讨,以期为莪术“醋制入肝”理论的现代化诠释提供必要的佐证和科学的依据。课题研究的主要内容如下:1、通过查阅古今文献,从莪术化学成分、药理作用、体内过程、炮制及其机理等方面对莪术进行了系统整理,以完善理论基础。对肝纤维化的发病机制及治疗、微透析技术及活体荧光成像技术的原理及应用作了相关综述,为本论文制定切实可行的研究方案,确定研究考察指标及研究起点奠定了基础。2、选取浙江温莪术进行实验,参照《中国药典》2010年版一部有关规定制备生、醋莪术饮片,并对所得饮片的挥发油含量进行测定,结果生莪术饮片挥发油含量为1.92±0.17%,醋莪术饮片挥发油含量为1.52±0.13%,符合药典规定,可用于后期实验研究。3、采用UPLC-TOF/MS方法对生、醋莪术饮片提取物进行多组分定性分析,准确测定化合物的准分子离子质荷比,通过计算元素组成得到待测物的分子式,与文献及专业数据库相匹配,初步鉴定了莪术中20种代表性化学成分。采用PeakView软件记录生、醋莪术提取物总化学成分响应值及17种可稳定响应的成分的响应值,以响应值之比计算各成分的相对含量。结果可得生莪术饮片化学成分总响应值为18638627.0±3888307.3,醋莪术为14308138.3±2700374.7,莪术醋制后化学成分的总响应值有所降低,在所比较的17种成分中,醋制后Dehydrocurdione、Curcarabranol、Bisacurone三种成分的响应值有所升高,其余化学成分的响应值均有所降低。按相对含量比较可得,莪术醋制后Curcumol、Turmerone、Procurcumenol、Dehydrocurdione、Curcarabranol、Bisacurone 六种成分所占的比例呈升高趋势。由此可见,莪术醋制后化学成分发生了一定的质变和量变。4、采用皮下注射40%CCl4橄榄油溶液,合并灌胃酒精及饲喂高脂饲料建立大鼠肝纤维化模型,采用全自动生化仪及病理切片等方法系统评价生、醋莪术抗肝纤维化的作用。结果表明生、醋莪术均可不同程度的改善大鼠肝纤维化程度,但醋制莪术疗效明显优于生莪术。与模型组相比,莪术醋制后可显著降低MDA水平(P<0.01),提高SOD活性(P<0.01),且高剂量组效果较优,由此提示莪术醋制后可能对机体的脂质代谢与抗氧化过程产生了重要影响。5、研究建立了血液、肝脏双位点同步微透析系统,以莪术二酮、莪术醇为对象,采用RRLC-MS技术测其血药浓度,运用WinNonlin软件按非房室模型计算药动学参数,从效应成分的药动学角度推测莪术醋制入肝的机制。实验首先对探针回收率的体内外校正方法及相关影响因素进行考察,确定了反透析法可作为体内微透析研究中莪术二酮、莪术醇回收率的校正方法,为进行在体药动学研究提供了依据。药动学结果显示,大鼠灌胃给予生莪术后莪术二酮的肝组织分布率(AUCliver/AUCblood)为0.37±0.08,莪术醇的肝组织分布率为0.85±0.11,大鼠灌胃给予醋莪术后莪术二酮的肝组织分布率为0.55±0.09,莪术醇的肝组织分布率为0.86±0.09,生、醋莪术组相比,莪术二酮的肝组织分布率有明显提高(P<0.05),因此推测莪术醋制后可能促进了莪术二酮在肝组织中的分布效应。6、中医所谓肝胆相表里,肝之余气生成胆汁,本课题选择与肝密切联系的胆汁为对象,基于代谢组学理论指导,采用UPLC-TOF/MS技术结合PCA多元统计分析和单维T-检验分析比较研究莪术醋制前后对胆汁代谢物组的影响,以P<0.05为限结果得到13个具有显著性差异的代谢物,以误差小于10ppm为限初步鉴定出其中9种。通过分析各代谢物的生物学意义,发现均与机体脂代谢途径相关,因此推测莪术醋制后对机体的脂质代谢途径产生了重要影响,主要包括调控磷脂代谢、促进脂肪转化作用。7、上述研究发现通过微透析联用RRLC-MS技术在5.5h后即检测不到大鼠血液及肝脏中的莪术醇,因此本项目探索性的应用荧光成像技术对莪术醇在裸鼠体内的吸收代谢过程进行可视化跟踪。结果发现莪术醇注射入裸鼠体内后,荧光立即分布于全身,5min后膀胱处即有显著的荧光富集,且强度高于其余组织,莪术醇在体内呈现明显的肾排泄特点。裸鼠肺组织、脑组织有明显的荧光强度,其代谢速率慢于心脏,肝脏由于表面积较大,其平均荧光强度稍弱,但总荧光光子数最高。莪术醇的体内过程在一定程度上与莪术的归经特点及足厥阴肝经的循行特点相吻合。综上所述,本课题针对性选择与莪术临床应用密切相关的肝纤维化病理模型为研究对象,比较莪术醋制前后疗效的差异并研究推测可能的机制。在此基础上,课题紧扣中医药整体观理念,创新性地将UPLC-TOF/MS、微透析、活体荧光成像等现代技术融入“醋制入肝”这一传统炮制理论研究领域中,研究结果进一步阐释了莪术醋制入肝的可能机制,同时也为传统中药醋制理论的现代化研究提供了新的思路。
