五味子有效成分分离纯化及对记忆障碍模型小鼠学习记忆的影响

学习和记忆是人类大脑的主要功能之一，是哺乳动物大脑的高级神经生理活动。然而，随着年龄的不断增长，学习和记忆能力的下降是伴随着年龄增长而出现的一种常见现象。生活条件的改善、老年人口的比例增加，将会有越来越多的人受到学习和记忆能力下降症状的困扰。因此，早期预防和治疗这种症状是目前研究的热点之一，具有非常广阔的市场前景。目前常用的药物包括自由基清除药、防止β-淀粉蛋白沉积药、M受体激动药和胆碱酯酶抑制剂等。这些药物或由于其较大的副作用，或由于昂贵的价格使其应用受到限制。中国传统的中草药由于其较低的毒副作用和明确的疗效，而成为人们研究与开发改善学习、记忆能力药物的研究热点。 五味子（Schisandra）是我国传统中药，传统中医认为五味子有镇静安神、止咳平喘、滋补强健和保肝护肝等作用。中华人民共和国药典（2010）收录有两种五味子药材，分别为北五味子（Schisandra chinensis (Turcz) Baill）和南五味子（Schisandra Sphenanthera）的成熟果实。北五味子又名五味子，主产于东北，内蒙古等地，其药用成分高、疗效显著而著称，优于南五味子。在上千年的中医临床应用中，主要用于治疗久嗽虚喘、心悸、失眠、久泻不止、自汗、短气脉虚、内热消渴、津伤口渴、遗尿尿频、梦遗滑精、盗汗等症。五味子有效成分主要包括木脂素、多糖，挥发油、有机酸、脂肪油、氨基酸、色素、靴质等多种成分。目前为止，共分离鉴定出200余个化合物，其中含量较高、研究较多、较深入且应用较广泛的主要成分为木脂素，约150多种，其次为多糖和挥发油。五味子的药理作用涉及中枢神经系统、心血管系统、消化系统、生殖系统以及泌尿系统等各个方面。五味子中主要成分对中枢神经系统具有改善学习、记忆，镇静、催眠，抗衰老和镇痛等作用。 本研究以传统中药材五味子为研究对象，利用现代分离纯化技术制备五味子总木脂素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子多糖等活性成分，在整体上，以小鼠为试验对象，采用急性腹腔注射东莨菪碱建立记忆获得性障碍的拟痴呆动物模型，探讨五味子总木脂素、五味子多糖对东蓑若碱所致拟痴呆大鼠学习记忆行为学、自由基代谢、胆碱能神经递质和单胺类神经递质水平的影响。在分子上，以大鼠海马神经元HT22细胞为试验对象，用MTT、免疫荧光技术、流式细胞仪及Western blot等方法，研究五味子醇甲、五味子乙素的抑制细胞凋亡，保护神经细胞的作用。系统的研究了五味子提取物对东蓑若碱所致拟痴呆大鼠的学习记忆改善作用及其作用机制，为将其开发为新的抗痴呆药物提供一定理论依据。 1．通过正交试验法筛选出五味子木脂素的最佳提取工艺为：乙醇浓度为90%，料液比为10倍，超声提取时间30min，提取3次。通过柱层析法分离得6个五味子木脂素类化合物，分别为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素。 2．通过正交试验法筛选五味子多糖提取及纯化最佳工艺。最佳提取工艺为：料液比为1:10，蒸馏水提取3次，提取温度90℃，每次1h。最佳醇沉条件为：乙醇浓度90%，醇沉体积3倍，醇沉3次。采用H2O2脱色法，最佳脱色条件为：H2O2用量为4%，脱色时间120min，脱色温度45℃，溶液pH为7.0。采用酶法脱蛋白，最佳脱蛋白条件为：木瓜蛋白酶用量120IU/ml，pH5.5，酶解温度40℃，酶解时间60min。 3．Morris水迷宫法测试五味子总木脂素和多糖对东蓑若碱所致痴呆小鼠学习、记忆能力的影响。给予模型动物五味子总木脂素后，可以明显缩短寻其找平台的潜伏期、寻找平台的路径、增加第Ⅲ象限停留时间、第Ⅲ象限路程百分比和穿台次数。实验结果表明五味子总木脂素可以改善腹腔注射东莨菪碱使小鼠产生学习记忆障碍的症状，对东莨菪碱所致拟痴呆小鼠学习记忆获得性障碍有治疗的作用。而五味子多糖无此效果。 4．通过检测总木脂素和多糖对模型小鼠脑组织中自由基代谢及单胺类递质含量的影响，初步阐明其作用机制。五味子总木质素可以提高小鼠血液及脑组织中SOD和T-AOC活性，明显降低MDA、NO含量；升高ChAT的含量，而对AChE含量无明显影响。同时，可以可以显著降低模型小鼠脑组织NE,DA的含量，升高5-HT的含量。而给予五味子多糖后，对上述指标无明显影响。实验结果表明，五味子总木脂素一方面，可通过提高机体清除自由基的能力、降低脂质过氧化损伤程度、保护脑组织，减轻自由基对脑组局部的损害；另一方面，学习记忆能力的改善也与模型小鼠脑组织中单胺类递质含量的改变有关。 5．通过体外实验探讨了分离出的五味子醇甲、五味子乙素和五味子多糖对海马神经元HT22细胞的保护作用及可能的机制。五味子醇甲，五味子乙素各剂量组可不同程度的提高细胞对MTT的摄取能力，使HT22细胞活力增加，并且对H2O2诱导的海马神经元HT22细胞损伤有保护的作用，并且抑制HT22细胞凋亡，上调bcl-2蛋白，下调bαx蛋白，下调Caspase-3蛋白。而给予五味子多糖处理后，对上述指标无明显影响。实验结果表明，五味子醇甲、五味子乙素对HT22细胞的保护作用与其抗凋亡作用有关。