目的：创面愈合一般要经历炎症、增殖和重塑三个相互重叠的阶段,并伴随瘢痕(Scar)的产生而结束。增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)基本发生于创伤后1个月,是皮肤深度烧伤、严重创伤后致局部组织的异常修复,常伴瘙痒、局部麻木和感觉异常,影响美观,而且易导致各种肢体及功能障碍。目前瘢痕的发病机制尚不完全清楚,临床上治疗方法HS的方法较多,但疗效不确切。青川复合物是由中药有效提取成分川芎素(阿魏酸钠)、青藤碱按2：3比例配置构成。两种有效提取成分均有抗炎、镇痛等多种药理作用。近年发现川芎素还有抗肝、肺、肾组织纤维化的作用,青藤碱亦能显著抑制肾间质纤维化。此外,我们前期实验组通过家兔瘢痕动物模型,发现川芎素、青藤碱按2：3比例配置的复合物能有效抑制家兔瘢痕增生。本实验拟通过体外培养人瘢痕增生成纤维细胞(human hypertrophic scar fibroblast,HSFb),研究青川复合物对HSFb的增殖、凋亡及胶原合成的影响以及对TGF-β1/Smad蛋白信号传导通路中多个相关信号蛋白分子含量的影响,以明确青川复合物对HSFb的生物学作用并从信号传导通路初步探讨其可能的作用机理,为临床应用青川复合物防治HS提供实验依据。方法：1.HSFb的鉴定及传代培养细胞购买于上海素尔生物科技有限公司。通过HE染色、免疫细胞化学染色等方法对细胞进行鉴定,证实该细胞为人瘢痕增生成纤维细胞。使用含10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5%C02饱和湿度下培养及传代,本实验采用4-6传代细胞。2.实验分组及MTT法测定各药物组的LC砷、最佳有效时间设立空白对照组,川芎素组、青藤碱组、青川复合物组等3个药物实验组；MTT法测定各组药物对HSFb的LC50及最佳有效时间；设定各药物组的高、中、低3个有效剂量。3.MTT法测定对HSFb增殖的影响MTT法检测各组药物对细胞增殖的影响。4.对HSFb形态、凋亡及凋亡相关蛋白的影响电镜观察各组药物对细胞超微形态结构的影响；TUNEL法检测各组药物对细胞凋亡的影响；免疫组化检测各组药物对细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。5.对HSFb胶原合成的影响Western blot法检测药物对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成的影响。6.对TGF-β/Smad信号传导通路的影响Western blot法检测对TGF-β/Smads信号传导通路中的重要信号分子TGF-β i,p-Smad2/3,p-Smad4和p-Smad7蛋白的影响：检测比较TGF-β1, p-Smad2/3、 p-Smad4和p-Smad7等信号分子对HSFb增殖、凋亡及胶原合成的影响。结果：1.HE染色及免疫组化鉴定购买的细胞株为人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb).2.川芎素、青藤碱及青川复合物的HSFb的LC50分别为0.3075mg/ml、1.1285 mg/ml、0.938mg/ml;通过MTT法检测到各药物组作用于细胞的最佳抑制时间为48h;川芎素组高、中、低剂量设定为：0.003mg/ml,0.03 mg/ml,0.3 mg/ml;青藤碱组高、中、低剂量设定为：0.01mg/ml,0.1mg/ml, lmg/ml;青川复合物组高、中、低剂量设定为：0.008 mg/ml,0.08 mg/ml,0.8mg/ml,3.通过MTT法显示除低浓度青川复合物组以外,其余各组药物均能不同程度地抑制细胞增殖。4.川芎素、青藤碱及青川复合物作用于HSFb后,可引起HSFb的超微结构改变,如细胞体积变小,外形不规则,细胞核染色质聚集或核仁增大,粗面内质网减少,胞浆内出现空泡或凋亡小体；TUNEL法检测提示除低浓度的青藤碱组以外,其余各药物组能诱导细胞凋亡率增加;免疫组化法检测显示,青藤碱(中、高)组、青川复合物(高)及川芎素(高)组能下降细胞Bcl-2蛋白表达；中、高浓度的各组药物均能上调Bax及Caspase-3蛋白,且Bax升高幅度随浓度增加而增强。5.川芎素、青藤碱及青川复合物作用于HSFb后,Western blot法检测显示除低浓度川芎素对Colα1 (Ⅲ)蛋白表达无抑制作用以外,其他各组药物均能不同程度地抑(?)Colα1(Ⅰ)、Colα1 (Ⅲ)蛋白表达。6. Western blot法检测显示：(1)川芎素(高、中)组、青藤碱(高)组及青川复合物(高)组对HSFb的TGF-β1表达有抑制作用；(2)川芎素(高、中)组、青藤碱(高)组及青川复合物(高、中)组能抑制HSFb的P-Smad2/3表达,且抑制强度随浓度增加而增强；(3)川芎素(高、中)组、青藤碱(高)组及青川复合物(高、中)组能抑制HSFb中p-Smad4的表达；(4)川芎素(高、中)组、青藤碱(高)组及青川复合物(高)组能上调HSFb中p-Smad7的表达。青川复合物(高)、川芎素(高、中)、青藤碱(高)组在抑制细胞TGF-β1表达的同时,能显著抑常HSFb的增殖、显著诱导细胞凋亡和显著抑制Colα 1(I)、Colα1 (Ⅲ)蛋白表达；青川复合物(高、中)、川芎素(高、中)、青藤碱(高)组在抑制P-Smad2/3、 P-Smad4表达的同时,均能抑制Colα1(Ⅰ)、Colα1 (Ⅲ)蛋白表达。青川复合物(高)、川芎素(高、中)、青藤碱(高)上调P-Smad7含量的同时,均能诱导细胞凋亡、抑制一Colα1(Ⅰ)、Colα1 (Ⅲ)蛋白表达。结论：1.青川复合物从中浓度即0.08mg/ml开始能有效抑制1SFb的增殖,抑制强度随浓度增加而增强；2.青川复合物能影响HSFb的超微形态结构并诱导细胞凋亡；青川复合物促使Bc1-2蛋白的表达减弱,Bax及Caspase-3蛋白的表达增强,可能是其致HSFb细胞凋亡发生的分子基础；3.青川复合物能影响HSFb的生物学功能,包括抑制细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成、减少TGF-β1蛋白的分泌；4.青川复合物可能通过抑制TGF-β1、p-Smad2/3、p-Smad4蛋白的表达,同时上调p-Smad7蛋白而阻碍TGF-β/Smad信号通路传导,进而发挥抑制HSFb的细胞增殖和胶原蛋白合成以及诱导细胞凋亡的作用。
