鸡枞菌(Termitomyces albuminosus),又叫伞把菇、鸡丝菇、白蚁菇等,属于担子菌纲,伞菌目,侧耳科,鸡枞菌属,其营养丰富,味道鲜美,为珍贵的药食两用菌。研究表明鸡枞菌含有脑苷、皂苷、多糖、纤维素酶、多酚等多种活性成分,具有醒脑、镇痛抗炎和抗氧化等生物活性。另有研究表明,多糖类物质是鸡枞菌中主要的抗氧化活性成分。因此,本试验拟从如下三个方面探讨鸡枞菌多糖对酒精诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。
1、鸡枞菌多糖的提取和体外抗氧化作用。本试验采用超声波辅助的水提醇沉法从鸡枞菌子实体中提取出鸡枞菌粗多糖(CPTA),经Sevag法三次除蛋白后冷冻干燥得到鸡枞菌精多糖(RPTA),再经DEAE-Cellulose52离子交换柱和Sepharose4B柱得到鸡枞菌纯多糖(RPTA Ⅰ-a)。然后分别测定了CPTA、RPTA和RPTA Ⅰ-a的生物活性物质组成及对羟自由基(·OH)、超氧自由基(·O2-)清除作用和还原力分析。结果表明CPTA中含有多糖、蛋白质、还原糖、总酚和黄酮等成分,多糖含量为(32.032±0.488)g/100g,蛋白含量为(3.215±0.517)g/100g；RPTA不含黄酮和总酚,多糖含量达到(76.106±0.656)g/100g,蛋白含量只有(1.332±0.048)g/100g；RPTA Ⅰ-a几乎不含蛋白质,且其多糖含量则高达(96.569±0.393)g/100g。对RPTA Ⅰ-a进行紫外扫描,图谱显示其不含核酸和蛋白质。红外扫描RPTA Ⅰ-a表明多糖分子中含有吡喃环碳骨架等典型的多糖特征基团。通过对·OH、·02-清除率和还原力的测定,结果表明CPTA、RPTA和RPTA Ⅰ-a都有一定的抗氧化作用,且多糖纯度和浓度越高,抗氧化效果越好。
2、以RPTA为试验材料,建立小鼠急性酒精肝损伤模型,进行功能性试验研究及病理切片观察。小鼠被随机分为空白对照组、模型对照组、药物对照组(150mg/kg.bw)、 RPTA各剂量组(100、200、400mg/kg.bw)。连续灌胃30d。第31天,给予50%乙醇(12mL/kg)建立动物急性肝损伤模型。去除死亡小鼠,在灌胃12h后各组均取10只小鼠摘眼球血并分离血清,测定谷草转氨酶(GOT/AST)、谷丙转氨酶(GPT/ALT)、甘油三酯(TG)水平；取小鼠肝脏测定各项抗氧化指标,并采用石蜡切片分析小鼠肝损伤程度。结果表明,小鼠酒精灌胃后,模型对照组ALT、AST、TG、丙三醇(MDA)水平与空白对照组相比显著升高,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)水平显著低于空白对照组。说明酒精可造成抗氧化酶活力降低,并损伤抗氧化非酶体系,导致膜脂质过氧化物升高。而RPTA各剂量组可不同程度改善酒精代谢造成的损伤,降低AST、ALT、TG、MDA水平,不同程度提高SOD、GSH-Px活力和GSH含量。病理切片显示,模型对照组小鼠肝组织结构紊乱,中央静脉扩大,出现肝细胞片状坏死现象,而喂饲RPTA小鼠肝细胞及肝索均有所改善且有多个肝细胞细胞质呈深伊红染、核固缩状,见数个双核肝细胞,其中以高剂量组最为明显。以上结果提示RPTA可提高机体抗氧化能力,有效降低肝组织的损伤程度,对酒精所致急性肝损伤小鼠有明显的保护作用。
3、急性酒精肝损伤小鼠肝组织超微结构的观察和酒精代谢相关酶乙醇脱氢酶2(ADH2)、乙醛脱氢酶2(ALDH2)和细胞色素P4502E1(CYP2E1)mRNA表达。为进一步研究RPTA对酒精所致急性损伤小鼠的保护作用机理,本试验观察了小鼠急性酒精肝损伤肝组织超微结构的变化并采用荧光实时定量RT-PCR法检测了酒精代谢相关基因ADH2. ALDH2和CYP2E1mRNA表达。超微结构表明,造模后模型对照组视野内可见大量脂滴存在,小鼠肝细胞的细胞核变形,核膜不规则,线粒体严重变形,膜通透性增高,嵴模糊,粗面内质网肿胀严重,核糖体脱落；而喂饲RPTA组小鼠肝细胞中细胞核、线粒体及粗面内质网虽然有不同程度的损伤,但是与模型对照组相比,以上症状已经有较为显著的改善。荧光实时定量RT-PCR结果显示,造模后模型对照组ADH2及ALDH2的mRNA表达量较空白对照组降低,CYP2E1mRNA表达量较空白对照组明显升高,而预先喂饲RPTA小鼠肝脏的ADH2及ALDH2的nRNA表达量随着剂量的增加而逐渐升高,其中RPTA高剂量组ADH2mRNA表达量在5%水平上与药物对照组无显著性差异,ALDH2的nRNA表达量则在1%水平上与空白对照组无显著性差异,CYP2E1mRNA表达量明显降低,提示RPTA可上调ADH、ALDH2mRNA的表达,下调CYP2E1mRNA的表达,具有改善小鼠急性酒精肝损伤的作用。
