EHEC O157:H7二重PCR的建立及应用

被引：7

作者：

李丽 ^{[1
,2
]}

张雪寒 ^{[1
]}

何孔旺 ^{[1
]}

姜平 ^{[2
]}

赵攀登 ^{[1
]}

叶青 ^{[1
]}

栾晓婷 ^{[1
]}

温立斌 ^{[1
]}

倪艳秀 ^{[1
]}

周俊明 ^{[1
]}

吕立新 ^{[1
]}

郭容利 ^{[1
]}

俞正玉 ^{[1
]}

茅爱华 ^{[1
]}

李彬 ^{[1
]}

王小敏 ^{[1
]}

机构：

[1] 江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

[2] 南京农业大学动物医学院

来源：

华北农学报 | 2011年 / 26卷 / 06期

关键词：

O157:H7; 二重PCR; 方法建立; 细菌分离; 样品检测;

D O I：

暂无

中图分类号：

R440 []; S854.4 [兽医诊断学];

学科分类号：

摘要：

建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。

引用

收藏

页码：59 / 66

页数：8

相关论文

共 10 条

[1] 产志贺毒素EHEC国内分离株Stx2基因的克隆及生物信息学分析
唐中伟
周志江
[J]. 山西农业科学, 2011, 39 (02) : 167 - 169
[2] 出血性大肠杆菌O157:H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究
张雪寒
何孔旺
卢维彩
赵攀登
温立斌
李彬
郭容利
王小敏
倪艳秀
周俊明
俞正玉
茅爱华
吕立新
[J]. 华北农学报, 2010, 25 (04) : 180 - 185
[3] 出血性大肠杆菌O157:H7的Tir与stx1/2B融合基因的构建和表达
张雪寒
何孔旺
卢维彩
俞正玉
茅爱华
刘亚栋
[J]. 内蒙古农业科技, 2009, (03) : 59 - 61
[4] 肉类中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立
徐晓可
吴清平
周艳红
张菊梅
杨小鹃
[J]. 微生物学通报, 2008, (04) : 619 - 622
[5] 多重PCR快速鉴定大肠杆菌O157
梅明珠
严亚贤
陆承平
刘佩红
王建
沈莉萍
[J]. 中国人兽共患病学报, 2007, (04) : 351 - 354
[6] 多重PCR方法检测大肠杆菌O157∶H7的初步研究
朱文冠
薛素强
洪洁心
崔剑峰
郭霄峰
[J]. 中国人兽共患病学报, 2006, (05) : 428 - 432
[7] 天津市首次在羊粪便中检出O157:H7大肠杆菌
于凤泰
赵志武
陈继永
张凤芹
王艳玲
贾艳合
[J]. 医学动物防制, 2003, (05) : 268 - 270
[8] A multiplex PCR procedure for the detection of six major virulence genes in Escherichia coli O157:H7[J] . Jianfa Bai,Xiaorong Shi,T.G. Nagaraja.Journal of Microbiological Methods . 2010 (1)
[9] Preliminary FoodNet Data on the Incidence of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - 10 States, 2007[J] . Vugia,D,Cronquist,A,Hadler,J,Tobin-D’Angelo,M,Blythe,D,Smith,K,Lathrop,S,Morse,D,Cieslak,P,Dunn,J,White,P L,Guzewich,J J,Henao,O L,Hoekstra,R M,Scallan,E,Angulo,F J,Griffin,P M,Tauxe,R V,Behravesh,C Barton.MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report . 2008 (14)
[10] Methods available for the detection of Escherichia coli O157 in clinical, food and environmental samples[J] . Peter A. Chapman.World Journal of Microbiology and Biotechnology . 2000 (8)