基于双重微滴数字PCR精准定量转基因水稻G6H1的方法研究

转基因水稻(Oryza sativa) G6H1是我国自主研发的抗虫耐除草剂转基因水稻品系,抗虫和抗草甘膦性能良好,具有较好的应用前景,但目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。本研究基于微滴式数字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)平台建立了适用于转基因水稻G6H1品系的双重ddPCR精准定量方法。通过对不同作物的qRT-PCR实验,验证了用于G6H1转化体事件检测的引物与探针的特异性;对4个候选内源基因进行数字PCR扩增,筛选出了适合双重ddPCR检测的水稻内标准基因,进一步对双重ddPCR的引物和探针的浓度及退火温度进行了优化和选择,建立的转基因水稻G6H1双重ddPCR定量分析方法,对内外源基因的检测限达到3拷贝,对内外源基因的定量限在25拷贝,定量结果的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)小于25%。最后,比较了单重实时荧光定量PCR (quantitative real-timePCR, qRT-PCR)、单重ddPCR和双重ddPCR三种方法,对转基因水稻G6H1含量分别为5%、1%和0.5%样品的定量结果。结果表明,建立的转基因水稻G6H1双重ddPCR方法特异性好、灵敏度高、精准可靠,适用于精准定量转基因水稻G6H1转化体成分。该方法的建立为转基因水稻G6H1定量检测提供了新方法,完善了我国转基因水稻成分定量检测技术体系,为农业转基因生物安全阈值管理增添了技术储备。