纯化血小板对大鼠软骨细胞增殖及膝骨关节炎大鼠软骨修复的作用研究

目的:观察纯化血小板（purified platelet rich plasma,pPRP）对大鼠软骨细胞增殖及膝骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）大鼠软骨修复的作用。方法:取5只SD大鼠抽取腹主动脉血,经多次离心后获得pPRP,并制成低(1×10～6个·mL-1)、中(1×10～7个·mL-1)、高(1×10～8个·mL-1)3种浓度的pPRP。5只SD大鼠抽取腹主动脉血后脱颈处死,取膝关节软骨分离软骨细胞。将培养的第3代软骨细胞分为生理盐水组、pPRP低浓度组、pPRP中浓度组和pPRP高浓度组,每组设5个复孔。各组细胞以无血清IMDM培养基处理后,生理盐水组更换为含10%FBS的培养基,pPRP低浓度组、pPRP中浓度组和pPRP高浓度组分别更换为含10%FBS和低、中、高浓度pPRP的培养基。分别于培养24、48、72 h后采用CCK-8法测定细胞增殖情况。另外选取30只SD大鼠随机分为空白组、KOA模型组和pPRP治疗组,每组10只。KOA模型组、pPRP治疗组大鼠通过向双侧膝关节腔内注射碘乙酸进行KOA造模,空白组不进行造模。1周后,向pPRP治疗组大鼠双侧后肢膝关节腔各注射50μL高浓度pPRP,向空白组和KOA模型组大鼠膝关节腔注射等量生理盐水,每周1次,共注射4次。药物干预结束后分别对各组大鼠进行步态分析、膝关节X线检查及膝关节病理学观察。结果:①软骨细胞增殖测定结果。培养24、48、72 h后4组软骨细胞活力比较,组间差异均有统计学意义（0.411±0.014,0.458±0.052,0.473±0.029,0.489±0.011,F=5.860,P=0.007;0.502±0.003,0.551±0.022,0.568±0.019,0.572±0.029,F=12.196,P=0.000;0.619±0.008,0.747±0.006,0.754±0.031,0.763±0.018,F=67.065,P=0.000）。培养24 h后,pPRP低浓度组、pPRP中浓度组、pPRP高浓度组细胞活力均高于生理盐水组（P=0.026;P=0.003;P=0.000）;pPRP高浓度组和pPRP中浓度组的细胞活力均高于pPRP低浓度组（P=0.028;P=0.008）;pPRP高浓度组的细胞活力高于pPRP中浓度组（P=0.002）。培养48 h后,pPRP低浓度组、pPRP中浓度组、pPRP高浓度组细胞活力均高于生理盐水组（P=0.002;P=0.008;P=0.006）;pPRP高浓度组和pPRP中浓度组的细胞活力均高于pPRP低浓度组（P=0.033;P=0.027）;pPRP高浓度组的细胞活力高于pPRP中浓度组（P=0.002）。培养72 h后,pPRP低浓度组、pPRP中浓度组、pPRP高浓度组细胞活力均高于生理盐水组（P=0.000;P=0.000;P=0.000）;pPRP高浓度组和pPRP中浓度组的细胞活力均高于pPRP低浓度组（P=0.016;P=0.033）;pPRP高浓度组的细胞活力高于pPRP中浓度组（P=0.029）。②步态分析结果。3组大鼠跑步过程中单位时间内（1 s）左后肢和右后肢着地面积比较,组间差异均有统计学意义[（2.36±0.49）cm2,（1.68±0.18）cm2,（1.98±0.26）cm2,F=10.320,P=0.005;（2.82±0.59）cm2,（1.91±0.29）cm2,（2.41±0.31）cm2,F=11.790,P=0.002]。空白组、pPRP治疗组大鼠左后肢着地面积均大于KOA模型组（P=0.002;P=0.008）;空白组、pPRP治疗组大鼠右后肢着地面积均大于KOA模型组（P=0.001;P=0.002）;空白组与pPRP治疗组大鼠左后肢及右后肢着地面积比较,组间差异均无统计学意义（P=0.050;P=0.068）。③X线检查结果。X线片显示空白组大鼠膝关节软骨完整,关节面平整;KOA模型组关节软骨明显退变,胫骨平台与股骨远端关节面均不平整,有骨赘样组织形成,并有软骨缺损迹象;与KOA模型组相比,pPRP治疗组大鼠膝关节软骨退变程度较轻微。④病理学检查结果。与空白组相比,KOA模型组大鼠膝关节软骨面明显缺损,缺损处软骨细胞丢失,软骨细胞排列紊乱,软骨下骨硬化,骨小梁面积明显减小,骨髓腔细胞增生、排列紊乱,骨小梁中的骨细胞明显减少;pPRP治疗组大鼠膝关节软骨面基本光滑,表面未见明显缺损或裂隙,部分区域内可见软骨细胞丢失,软骨下骨骨小梁排列尚整齐,骨小梁稀疏变窄,部分断裂。结论:pPRP可促进大鼠软骨细胞增殖;高浓度的pPRP可以在一定程度上修复KOA大鼠退变的关节软骨,改善运动能力。