小龙虾钙结合蛋白的免疫学特性鉴定与单克隆抗体的制备

目的克隆、表达、纯化具有免疫原性的重组小龙虾钙结合蛋白(SCP),并制备高效价抗SCP单克隆抗体。方法用亲和层析法获取小龙虾重组SCP,通过Western Blotting和ELISA法进行免疫学活性鉴定;以重组SCP为免疫原,免疫BALB/c小鼠,再取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1进行细胞融合;利用ELISA法筛选出能分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,然后利用该杂交瘤细胞株刺激小鼠,取腹水,用蛋白A亲和层析方法纯化获得抗体;通过Ig类/亚类鉴定ELISA试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过Western Blot和间接ELISA法鉴定单克隆抗体的交叉性和特异性。结果经SDS-PAGE鉴定获得了纯度较高的重组SCP,免疫学鉴定结果显示,重组的SCP蛋白具有较好的IgE结合活性,阳性率为40%。通过杂交瘤细胞融合技术,共获得了抗SCP细胞株2株,分别命名为1A12和3H12,效价均高于20万。经抗体亚型鉴定,2株抗体均为IgG1型。Western Blot的结果表明2株抗体能识别重组SCP。在特异性检测实验中,1A12抗体与其他种类食物过敏原无交叉反应,而3H12与鱼粗蛋白过敏原有交叉反应性。结论 SCP是小龙虾的重要过敏原,本实验获得了纯度较高的重组SCP,并制备了2株高效价抗SCP单克隆抗体,为小龙虾SCP、甲壳类食物过敏原的检测及标准化过敏原物质的制备奠定了基础。