0-6个月婴儿在不同喂养方式下肠道菌群的建立及其影响

目的:婴儿期是肠道菌群关键定植时期,早期的菌群定植模式直接影响婴儿在生后肠道的生理发育及免疫系统,从而影响远期疾病的发生风险。同时婴儿期的不同喂养方式影响了婴儿期的肠道菌群的建立,母乳喂养是公认的最佳喂养方式,也是婴儿期肠道菌群重要的来源。本研究通过Illumina高通量测序技术对肠道菌群进行分析,来揭示不同喂养方式下0-6个月婴儿肠道微生物菌群的定植、演变、以及喂养方式对肠道菌群的影响,为探讨肠道菌群与疾病发生关系提供理论依据。方法:选择2015年4月-2015年10月在吉林大学第一院出生且符合入选标准的足月新生儿20例,母孕期身体情况良好、经阴道自然分娩、围产期未使用抗生素、婴儿及双亲均生活在长春市,气候环境,居住环境,饮食结构等相当。分母乳喂养组(10例)及配方奶粉喂养组(10例)两组。采集婴儿出生后第14天、2个月、4个月、6个月的粪便标本,母乳喂养组的分别设定为A-D组;配方奶粉喂养组的设定为E-H组;随后将冻存于-80℃冰箱中,并随访记录婴儿健康情况及喂养状况。采用MOBIO公司的MOBIO试剂盒提取粪便DNA,采用Illumina高通量测序技术对16Sr DNA基因的V3-V4可变区引物通过PCR扩增,检测肠道菌群门、纲、目、科、属的鉴定。结果:1.入组婴儿20例,收集自生后14天,第2个月、4个月和6个月龄粪便标本,应收集粪便标本80份,实际收标本64份。其中1份粪便提取DNA失败,1份标本扩增失败。共计62份标本进入测序程序,经过滤筛查后共获得有效总序列为3641096,总碱基数为1524372983bp,平均长度418.23 bp。2.对62份粪便标本进行测序,测得459个门,430个纲、410个目、378个科、318个属。总测序量达100%以上的菌种共为5个,分别为不动杆菌属、肠杆菌科、韦荣氏球菌属、大肠杆菌/志贺菌属、肠杆菌属。婴儿粪便中微生物多样性很高,检测出491个物种。3.母乳喂养组主要优势菌:在门水平上以变形菌门为主要优势菌、其次是厚壁菌门、放线菌门。在纲水平上主要以γ-变形菌纲为主要优势菌、其次为梭菌纲及放线菌纲Negativicutes纲为主。在目水平上以肠杆菌目为主要优势菌、其次分别为梭菌目、双歧杆菌目、Selenomonadales目。在科水平上肠杆菌科为主要优势菌,其次为双歧杆菌科、韦荣球菌科及毛螺旋菌科。在属水平上大肠杆菌-志贺菌属为优势菌,其次为双歧杆菌属、克雷伯氏菌属及韦荣氏球菌属。4.配方奶喂养组主要优势菌:在门水平上以厚壁菌门为主要优势菌、其次是变形菌门、放线菌门、拟杆菌门。在科水平上韦荣球菌科为主要优势菌,其次为肠杆菌科、梭菌科、双歧杆菌科、及红蝽杆菌科。在纲、目、属水平上的优势菌与母乳喂养组基本相似。但菌群丰度及多样性比母乳喂养组丰富。不同喂养方式间肠道菌群存在显著差异。5.0-6个月母乳喂养组中肠道菌群变化:厚壁菌门、梭菌纲、韦荣氏球菌科、梭菌目、韦荣氏球菌属从生后至4个月逐渐增多,6个月时有下降趋势。变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌科、肠杆菌目、大肠杆菌属/志贺菌属从出生后至4个月逐渐下降,6个月时上升趋势。放线菌门从出生后至4个月逐渐下降、6个月时上升趋势;放线菌纲从出生后至6个月逐渐上升趋势;双歧杆菌科、双歧杆菌目、双歧杆菌属从出生后的8.5%上升至2个月的15.5%,4个月时下降至11.0%,6个月时上升至27.0%。6.0-6个月配方奶粉组肠道菌群变化:厚壁菌门、梭菌纲、韦荣氏球菌科、梭菌目、韦荣氏球菌属从生后至4个月逐渐下降,6个月时明显上升趋势。变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌科、肠杆菌目、大肠杆菌属/志贺菌属从生后4个月逐渐增多,6个月时下降趋势。放线菌门、放线菌纲从生后至4个月下降、6个月时上升趋势;双歧杆菌科、双歧杆菌目、双歧杆菌属从生后的6.6%下降至2个月的4.1%,4个月上升至11.1%,6个月时下降至9.2%。结论:1.Illumina高通量的16Sr DNA测序技术对婴儿肠道微生物群落的门、纲、目、科、属种类分析方法可靠、有效、准确性高。2.0-6个月足月健康婴儿,婴儿粪便中微生物多样性很高,最多检测出491个物种。配方奶喂养婴儿粪便微生物物种丰度高于母乳喂养组。母乳喂养组及配方奶喂养组间差异有统计学意义(P<0.05)。3.在肠道菌群的门水平上主要以变形杆菌门、后壁菌门、放线菌门为优势菌。在纲、科、目、属水平上优势菌组成基本相似。母乳喂养婴儿早期肠道中双歧杆菌科、双歧杆菌目、双歧杆菌属增高明显。而配方奶喂养婴儿肠道内以上菌群增高不明显。