柑桔果实有机酸代谢生理和奉节脐橙芽变株系的AFLP分析研究

柑桔营养丰富，果形优美，色泽艳丽，极受人们喜爱，是世界上最重要的水果之一，占水果总量的20—30％。我国是柑桔的原产地，品种资源丰富，加之生态条件优越，土地资源广袤，市场容量巨大，具有相当大的可持续发展优势和潜力。据FAO统计，2000年度中国柑桔总产已达1178万吨，为我国仅次于苹果的第二大水果，是中国南方最大宗的果树作物。但我国柑桔业发展有许多影响因素，除品种结构和布局分布不合理，宽皮柑桔所占比例过多；管理落后，栽培面积虽大而单位面积产量不高，以及集约化商品化水平低下，流通环节不规范，还存在成热期过于集中，早、中、晚熟品种不配套(优质多种如晚熟脐橙至今尚无商业载培)，果实品质良莠不齐等问题。随着我国国民经济的发展，城乡消费水平的提高特别是加入WTO后面临的严峻市场竞争，怎样在增加产量的同时，调整品种结构，提高果实品质，就成为我国柑桔业函待解决的问题。 果实中糖、酸含量和糖酸比或固酸比是决定柑橘品质的最重要的指标。现在我国柑桔许多产区，普遍存在的一个问题就是酸含量过高，糖酸比太低。因此，研究柑桔果实中有机酸的代谢，从生理和分子水平上探索柑桔果实有机酸积累的机制，进而对其调控，具有重要的理论和实践意义。柑橘有机酸含量是以一种半数量形式的遗传，因而有机酸代谢涉及的生理过程和影响因素也多。关于柑橘果实有机酸代谢的研究，前人研究不多，相关酶活性研究往往仅涉及一种酶或一个柑橘品种，难以说明造成各种或品种果实有机酸含量差异的原因；就已有的研究结果来看影响柑橘果实有机酸代 柑桔果实有机曲代谢生理和奉节脐橙芽变株系的AFLP分析研究 谢，造成不同柑橘种、品种间有机酸含量差异的原因是多种多样的，一类柑橘果实酸 代谢的关键影响因子不一定就是影响另一类柑橘的关键因素，结合栽培和环境因素的 影响，有理由相信柑橘果实有机酸代谢一定涉及远为复杂的代谢方式和过程而不仅仅 局限于己测定的几种酶，因此有必要从分子生物学的角度进行进一步的探索，但是由 于柑橘类果树遗传背景非常复杂，多年生，以营养繁殖为主，往往多胚，杂交后代获 得不易且时间长，无论运用FZ分离群体组成的近等基因池oUlk）进行集群分类o segregant analysis，BSA），还是培育近等基因系（near isogenic line，NIL），用分 子生物学手段研究其性状变异的生理机制，筛选与性状连锁的分子标记进而分离克隆 基因的方法都十分困难，特别难以找到合适的材料。 本研究取样以高酸的尤力克柠檬（CI ins L讪 BUrm历，低酸的冰糖橙（C Sjnensis osbeck和中酸的锦橙（b SjDenSls OSbeCk为参照，重点研究比较奉节脐橙 ＊ Sjnensjs OSbeCk 72l及其低酸和晚熟芽变，首次同时比较几个柑橘种和品种的几 种与果实有机酸代谢相关的酶活性，测定的有机酸代谢酶包括磷酸烯醇式丙酮酸梭化 酶（Phosphoenolpyruvateca劝oxylase，PEPc，Eo．l．l．31）；柠 檬 酸 合 成 酶 （Citrate－synthase，CS，EC4．二．3．7），乌头酸酶（Aconitase or Aconitate hydratase，EC 4．2．1．3），NAD异柠檬酸脱氢酶（NNIsocitrate dehrdrosenase，NAI：hIDH，ECI．1．1．41）和 苹果酸脱氢酶伽slstedehyd＊＊ge＊SSe，MDH，EC．1．1．37）；并用AFLP方法比较果实有机酸 含量发生变异的脐橙芽变及其母系的基因组DNA，筛选出其AFLP特异片段并克隆测序。 研究结果如下： 1．柑橘果实有机酸代谢相关酶活性的变化 门）柑橘果实有机酸的季节变化 在本试验中，柠檬和锦橙前期酸度较大（＞2％人锦橙7月后增加小，而柠檬则仍 在迅速上升，直到ic月以后才停止；脐橙明显低酸（＜1％人但脐橙及其芽变在前期 差异很小，直到9月前均十分相近，以后低酸72d下降很快，晚熟芽变与72习在含 酸量和变化上均无太大的区别；冰糖橙则一直很低（＜0．5％人各类型柑橘果实发育 过程中有机酸含量除柠檬外均在花后100d30天达到高峰以后逐渐下降，测定结果与 前人的研究一致。 ．2． 柑桔果实有机酸代谢生理和奉节阶橙芽变株系的AFLP分析研究 Q）柠檬酸合成酶优S）对柑橘果实有机酸积累的影响 在有机酸含量明显差异的柑橘种、品种之间，看不出果实发育过程中CS活性变化 与有机酸含量差异有何明显联系，表明CS虽然是柠檬酸合成的关键酶，但并非造成柑 橘果实酸含量差异的原因，这与SadkaO000入CanelO）等人的研究结果相似。 （3）磷酸烯醇式丙酮酸脱氢酶和PEPC／NAthIDH 磷酸烯醇式丙酮酸脱氢酶影响柑橘果实对C矿的暗固定。晚熟72习和冰糖橙PEPC 活性变化类似，花后120七00天比较平缓，其它类型在此期间＊30天左右）有一明 显下降过程，而低酸芽变前期活性高于所有类型，中后期下降较大，说明柑橘果实发 育后期PEPC活性较低，有利于柠檬酸的下降；柑橘各类型的NNIDH活性在发育前期 升高，花后100《80天变化较小，180天后迅速上升，PEK／NANIDH比值低酸芽变前 期